ADAM33基因DNA甲基化水平与哮喘患者的关联性研究

胡 昕， 齐曼古力·吾守尔， 王 菲， 孙 慧， 江道斌， 文 进， 吴佩环， 王 晶

(新疆医科大学1第一附属医院呼吸与呼吸危重症中心一病区， 乌鲁木齐 830054； 2第二附属医院重症医学二科， 乌鲁木齐 830028)

支气管哮喘(简称哮喘)近年来的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势[1]。在哮喘的治疗中，某些传统药物疗效并不理想，甚至是基因药物。随着遗传学的进展，表观遗传学连通了环境与遗传这两大系统，为该病的治疗带来了新的契机，DNA甲基化是它主要调控机制之一。有研究提示ADAM33基因DNA甲基化程度与哮喘存在一定关联性[2-4]。目前，ADAM33基因DNA甲基化水平与新疆成年人哮喘的关联性研究鲜有报道。本课题运用亚硫酸氢盐PCR测序(BSP)技术检测ADAM33基因CpG岛的DNA甲基化程度，初步探索其DNA甲基化水平与新疆成人哮喘的关联性，为哮喘的个体化治疗提供线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年11月-2014年12月经新疆医科大学第一附属医院呼吸科住院的、明确诊断哮喘的成人患者10例作为哮喘组，哮喘组均符合中华医学会2012年制定的《支气管哮喘防治指南》，其中，男性5例，女性5例，平均年龄为(45.10±12.02)岁，吸烟人数7人，FEV1/FVC为(62.88±7.45)%，FEV1/预计值为(98.90±23.98)%。依据1∶1的配对原则，对照组10例选取了同期、同居住地、性别搭配、年龄相距在5岁以内且与哮喘组无血缘关系的健康体检者，其中，男性5例，女性5例，平均年龄为(45.10±12.14)岁，吸烟人数4人，FEV1/FVC为(79.29±4.72)%，FEV1/预计值为(103.10±14.68)%。所有病例年龄为15～65岁。经过统计分析2组具有可比性。该研究已经通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会考核批准(审批号：20131011-06)，且全部受试者均已获得知情同意。

1.2 主要实验试剂血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司),KAPA 2G Robust HS PCR Kit with dNTPs(KAPA BIOSYSTEMS),pGM-Simple-T Fast 克隆试剂盒(TIANGEN),EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN),pMD-18-T(TaKaRa)。

1.3 ADAM33基因CpG岛上下游引物的信息上游引物序列(5′to 3′)为TTAGGAGTAGAGGTTTTTTGAGAT。下游引物序列(5′to 3′)为CTAACCTACCCCTCAAAAC。产物大小为482 bp。

1.4 DNA经亚硫酸氢盐修饰处理取外周血提取DNA(1～500 ng) 5 μL 置于200 μL EP管中，加入亚硫酸盐混合液85 μL、RNase-Free H2O 35 μL、DNA保护溶液15 μL，总体积140 μL。PCR反应条件依次为：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃ 5 min，60℃ 175 min，12℃保存。并进行纯化亚硫酸盐修饰的DNA。

1.5 甲基化PCR反应PCR反应体系总体积25 μL，具体如下：甲基化修饰的DNA 1 μL、5×KAPA 2G BufferA 5 μL、5×KAPA Enhancer1 5 μL、dNTP Mix(10 mm) 0.5 μL、Primer F(10 uM) 1 μL、Primer R(10 uM) 1 μL、KAPA 2G Robust Hotstart(5 U/μL) 0.1 μL、ddH2O211.4 μL。PCR反应条件依次为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，退火温度58℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 7 min，4℃保存，第2～4步循环39次。

1.6 克隆测序对甲基化PCR反应产物进行克隆测序。目的基因与质粒载体的连接体系如下：ds cDNA 80 ng、2×Ligation Buffer 5.0 μL、T Vector(50 ng/μL) 0.5 μL、ddH2O 加至10 μL。16℃水浴、连接过夜。经过大肠杆菌转化、重组菌的鉴定，阳性菌进行测序(ABI3730)。克隆测序时，发现反向引物测序的结果较好，因此所有测序用M13反向引物测序，将测序序列反向互补后再进行分析。

1.7 序列对比用BiQ_Analyzer分析软件对DNA序列和测序序列进行比对。

1.8 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析。两样本计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA甲基化程度分析分析ADAM33基因CpG岛I克隆测序和数据，测序图分析结果见图1、2。哮喘组CpGⅠ甲基化程度为(63.88±9.86)，对照组CpGⅠ甲基化程度为(53.67±5.44)，差异有统计学意义(P=0.010)。在哮喘组和对照组之间比较，ADAM33基因CpG岛Ⅰ中19个CpG位点(位点1、3、7、8、14、16、17、19、20、24、25、26、30、31、32、34、35、47、48)差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 ADAM33基因CpG岛Ⅰ的CPG位点DNA甲基化程度差异分析

注： 与对照组比较，△P<0.05。

图1 哮喘组ADAM33基因CpG岛Ⅰ的DNA甲基化程度分析

图2 对照组ADAM33基因CpG岛Ⅰ的DNA甲基化程度分析

2.2 CpG岛Ⅰ DNA甲基化程度与肺功能的相关性CpG岛Ⅰ DNA甲基化程度与FEV1/FVC呈负相关，差异具有统计学意义(γ=-0.515，P=0.020)，即甲基化程度越高，FEV1/FVC越低；CpG岛Ⅰ DNA甲基化程度与FEV1/预计值呈负相关，差异无统计学意义(γ=-0.181，P=0.446)。

3 讨论

作为呼吸系统常见疾病，哮喘涉及各个年龄段的人群，虽然医疗技术不断进步，但是哮喘仍然无法治愈，甚至部分患者很快出现了哮喘的并发症。近年来，学者们开展了DNA甲基化作用与哮喘的相关研究，并发现在基因转录过程中，DNA甲基化起了重要的调控基因组功能的作用[5-6]。

在不同地域中， ADAM33基因与哮喘的相关性研究结果并不完全一致，遗传背景和环境暴露因素都可能是不容小觑的影响因素。在ADAM33启动子中CpG岛的作用十分重要，由于ADAM33在上皮细胞出现超甲基化状态表达，而在成纤维细胞中则为不表达。Naumova等[2]研究发现：在17q12-q21位点中，女性儿童DNA甲基化水平明显高于男性儿童，其哮喘患病率也相应降低；在男性中，成人DNA甲基化水平明显比儿童高；从而解释了儿童期中男性哮喘比例明显高于女性，但在成年后患病率差异缩小。

本课题研究显示：ADAM33基因CpG岛Ⅰ的DNA甲基化水平不完全一致，存在部分CpG位点在2组间的表达有统计学差异，且CpG岛Ⅰ的甲基化程度在2组间有统计学差异，哮喘组甲基化程度显著高于对照组。本研究中比较CPG岛DNA甲基化程度与肺功能的相关性，结果显示，CPG岛I DNA甲基化程度与FEV1/FVC呈负相关，差异具有统计学意义，即甲基化程度越高，FEV1/FVC越低，肺功能越差；CpG岛Ⅰ的DNA甲基化程度与FEV1/预计值呈负相关，但差异无统计学意义，提示ADAM33基因DNA甲基化水平与哮喘的发病可能存在一定的关联性。与Yang等[3]研究不一致，其研究显示：所有样本ADAM33 exon9具有14个高度甲基化CpG位点，病例和对照之间甲基化频率无显著差异。此情况考虑可能与研究对象所处的环境有一定关系，如：生活环境、饮食环境、粉尘接触等。有待于进一步增加样本量证实该结果，并且进行更加深入的研究，为哮喘的治疗提供更多的理论依据。