γ-干扰素对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因表达的影响

文 进， 木叶沙尔·皮达义， 龚新记， 胡 昕， 郝艳艳， 闫 芳， 张立媛， 王 晶

(新疆医科大学1第二附属医院重症医学二科， 乌鲁木齐 830028； 2第一附属医院呼吸与呼吸危重症中心一病区， 乌鲁木齐 830054)

近年来，全球支气管哮喘(简称哮喘)的发病率和死亡率随时间有逐渐上升的趋势，给患者家庭和社会带来明显影响，已成为当今世界严重危害人类健康的疾病之一[1]。哮喘是一种多种细胞参与的慢性炎症性疾病，而长期气道炎症的存在最终导致气道重塑，由此可导致气道不可逆性的阻塞和气道高反应性。气道重塑主要表现为上皮细胞化生、气道壁的纤维化、平滑肌细胞增生和肥大、气道壁血管的增生[2]。这些改变的严重程度与患者的病情呈正相关。解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33)位于第20号染色体短臂13号位(20p13)，是近年来新发现的哮喘易感基因之一[3-4]，既往研究表明它存在于所有哮喘患者的支气管平滑肌细胞和基底膜中，其表达水平高于正常对照组，且与哮喘的严重程度成正比。多项研究已经证实ADAM33与哮喘的气道重塑相关[3, 5-6]。哮喘病因复杂，Thl/Th2细胞因子表达失衡是哮喘发病机制之一，而干扰素-γ(IFN-γ)是Th1细胞因子的代表，它通过调控Th1、Th2细胞因子活性变化进一步影响哮喘慢性炎症的发生、发展。本研究探讨IFN-γ对体外培养的人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 肺组织来源 2013年1月-2015年5月在新疆医科大学第一附属医院胸外科行手术治疗的肺大泡患者的患肺切除的肺组织，该部分患者同时合并有支气管哮喘。该研究已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准(批准号：20170214-50)，所有纳入研究的患者都已签署知情同意书。

1.1.2 仪器 去RNA酶，DNA酶枪头，PCR试管，96孔PCR反应板，384孔PCR反应板，去离子水生成器，Nunc PCR cover，PCR反应扩增仪，7900HT q PCR系统，SW-CJ-1D洁净工作台，H6-1微型电泳槽，DYY-8型稳压稳流电泳仪，YXJ-2离心机，凝胶成像系统，TU-1901紫外分光光度计，StepOne型荧光定量PCR仪，移液器。

1.1.3 试剂 IFN-γabcam抗体，DNase试剂盒，蛋白标记物，蛋白预染分子量标记物试剂盒，SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，抗兔平滑肌a肌动蛋白单克隆抗体，小鼠β葡萄糖醛酸苷酶ELISA检测试剂盒，标准胎牛血清，胰蛋白酶粉，RPMI-1640干粉培养基，D-Hanks粉，青霉素钠、硫酸链霉素，核糖核酸酶抑制剂试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 分组 分成4个不同IFN-γ刺激浓度(0.1、1、10和100 ng/mL)的实验组和1个空白对照组，5组中均加入相同体积的细胞培养液，同一环境下培养24 h后，结束研究实验。比较在不同IFN-γ刺激浓度下气道壁血管平滑肌细胞ADAM33表达的变化。各实验组及空白对照组均进行2次实验。

另将支气管血管平滑肌细胞和IFN-γ共培养，设置IFN-γ的刺激时间分别是0、6、12、24、48和72 h，同时设立没有IFN-γ的空白对照组，每组中加入相同体积的细胞培养液，刺激结束后测定ADAM33基因表达。

1.2.2 细胞培养 手术中切除的肺组织标本用D-Hanks液反复清洗，剥离组织中血管，把获得的标本用组织剪成1 mm×1 mm的小块，将小块放入浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶液中，在37℃的温度下保存15 min，使用离心机每分钟980转的速度离心10 min。将离心后的组织块放入25 mL的培养瓶后在CO2恒温箱中以37℃恒温培养，同时加入浓度20%的胎牛血清，培养时间设定为3～4 h，每隔4～5 d换一次培养液，当沿着培养瓶周边生长的细胞汇合到一起时，按1∶2进行传代，每隔5～7 d传代一次。使用显微镜观察时发现，气道壁血管平滑肌细胞有规律的平行排列在一起，呈“谷峰状”。不断扩增培养瓶内细胞，直至细胞数量增至2×106时，每个实验组分别给予IFN-γ刺激。

1.2.3 RNA抽取 在刺激结束后加入1 mL Trizol试剂使细胞充分裂解，加入50 μL氯仿混匀15 s，放置5 min，以每分钟13 000转的速度 4℃恒温下离心15 min；取上层液加入1∶1倍数的异丙醇和1 μL动物淀粉，震荡均匀，静置在-70℃的温度下30 min，在4℃的温度下以每分钟13 000转的速度离心15 min。弃上清液，使用75%的乙醇洗涤下层沉淀物，自然光下晾干，焦碳酸二乙酯溶解。

1.2.4 cDNA合成 在0.2 mL 体积PCR产物的试管中，按顺序逐个加入以下试剂：5 μL RNA，1 μL Random Primer p(dN)，5 μL Rnase-free H2O。混匀后以70℃的温度温浴5 min，然后冰浴10 s后再次离心，并加入下列试剂：4.0 μL 5*Reaction Buffer，2.0 μL dNTP Mix，1.0 μL Rnase inhibitor，2.0 μL AMV Reverse Transcriptase，20.0 μL Total volume。最后将产物在37℃、42℃、70℃的温度下分别温浴5 min、60 min、10 min，温浴结束后停止实验，置-20℃环境中保存。

1.2.5 实时定量PCR分析 实验开始前需要配制反应混悬液，所需试剂包括：cDNA模板2 μL，引物0.7 μL，MgCl20.3 μL，dNTP 0.75 μL，FCD 1 μL，SYBR Green I液2.5 μL，real time PCR buffer 5 μL，H2O 12.5 μL。将按照上述方法配制的样品放置于95℃的恒温下反应2 min，顺次以95℃ 10 s、60℃ 40 s的顺序重复40个循环。在荧光定量PCR仪中进行混合反应，并收集荧光信号。利用荧光定量分析仪采集实验中定量PCR的结果，得出目的基因和参比基因的CT值。循环结束，绘制溶解曲线，如曲线无尖峰，则为阴性。

1.2.6 提取气道壁血管平滑肌细胞蛋白 依据上述分组，将IFN-γ与气道壁血管平滑肌细胞培养产物中加入2 mL 磷酸盐缓冲液，混匀后重复洗涤2～3遍，然后放置冰块上；将10 μL PMSF与1 mL RIPA裂解液充分摇匀，取上述配制好的混合液400 μL缓慢加入到细胞瓶中，将细胞瓶放置于冰块上30 min，待细胞粉碎裂解后，在4℃下离心12 min，转速为每分钟12 000转；采用BCA蛋白定量的方法测定细胞瓶中的细胞总蛋白浓度，每个药品终浓度均调整为2 μg/μL，以-80℃温度下保存。

1.2.7 Western blot检测ADAM33蛋白的表达水平 在每个样品中提取等量的总蛋白，加入同体积loading buffer缓冲液，充分混合摇匀，在水浴锅中煮沸5 min，在4℃的环境下放置，然后分别在60 V、120 V的电压下电泳30和90 min。当溴酚兰逐渐沉淀到底端的时候，停止电泳，开始转模，转模后采用免疫杂交的方法进行显色分析，通过凝胶成像分析系统分析光密度。

2 结果

2.1 标准曲线和线性范围依据不同的IFN-γ刺激浓度和刺激时间，绘制出环DNA模板浓度和基因CT值之间的关系曲线，曲线方程为Y=-3.356×log(X)+29.43，曲线斜率为-3.356，斜距为29.43，相关系数为0.986(图1)。

2.2 RT-PCR产物分析ADAM33基因RT-PCR产物融解曲线在87℃时出现尖峰，且溶解温度基本稳定，具有高度的特异性(图2)。利用PAGE电泳的方法获得的蛋白产物性质比较稳定，是目的条带(图3)。

图1 cDNA模板浓度和基因CT值之间的关系曲线

图2 ADAM33基因的融解曲线

图3 聚丙烯酰胺凝胶电泳所得条带(左图为ADAM33蛋白电泳结果，右图为ADAM33mRNA电泳结果)

2.3 给予不同浓度的IFN-γ刺激后ADAM33基因的表达情况实验中，当给予较低浓度(0.1 ng/mL)IFN-γ刺激人气道壁血管平滑肌细胞时，ADAM33 mRNA表达量较对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；之后ADAM33 mRNA的表达量随着刺激浓度的增加有逐渐下降的趋势。当IFN-γ浓度为1 ng/mL时，ADAM33 mRNA的表达量较对照组减少了(0.85±0.04)倍；当IFN-γ浓度为10 ng/mL时，ADAM33 mRNA的表达量减少了(0.74±0.02)倍；当IFN-γ浓度为100 ng/mL时，ADAM33 mRNA的表达量减少了(0.69±0.09)倍，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。与对照组相比，不同浓度IFN-γ刺激下ADAM33蛋白表达量分别为(1.201±0.217)、(0.696±0.109)、(0.522±0.087)、(0.348±0.043)和(0.261±0.065)，呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，ADAM33蛋白条带灰度与对照组相比逐渐下降，差异有统计学意义，见图5。

图4 不同刺激浓度的IFN-γ对体外培养的人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33 mRNA表达的影响

图5 不同刺激浓度IFN-γ对ADAM33蛋白表达的影响

2.4 给予IFN-γ刺激后不同时间的ADAM33基因的表达情况研究中使用一定浓度(100 ng/mL)IFN-γ刺激体外培养的人气道壁血管平滑肌细胞时，ADAM33 mRNA的表达量随着刺激时间的推移，先呈逐渐下降的趋势后转为逐渐上升的趋势，各组的ADAM33 mRNA表达无统计学差异(P>0.05)(图6)。随着不同刺激时间的变化，ADAM33蛋白表达量变化趋势无明显规律性，无统计学差异(P>0.05)。蛋白条带前后灰度改变不明显，差异无统计学意义(P>0.05)(图7)。

图6 IFN-γ刺激后不同时间点的体外培养的支气管平滑肌细胞ADAM33 mRNA表达情况

图7 恒定刺激浓度的IFN-γ刺激后不同时间ADAM33蛋白表达情况的变化

3 讨论

ADAM33是目前世界上比较公认的哮喘易感基因之一。2002年由Van Eerdewegh等人[3]发现，并且他们对纳入研究对象的460个高加索家族人群进行了全基因组扫描，检测到位于人类染色体20p13的ADAM与哮喘密切相关，后又对该地区23个基因的135个基因多态性进行病例对照研究连锁分析，最后确认ADAM33基因与哮喘相关。研究发现ADAM33可以在间充质细胞中选择性表达，其活性改变可能会影响气道内的平滑肌细胞和成纤维细胞的结果变化及功能异常，进而导致气道重塑[6-8]。

IFN-γ是Th1细胞的一种细胞因子，介导细胞免疫，参与气道内炎性细胞的调控，目前研究认为哮喘的发病机制与Thl型细胞因子(IFN-γ)反应减弱有关[9]。在哮喘的发病机制中，IFN-γ通过抑制Th2细胞的活性减轻患者气道高反应性，从而减少嗜酸性粒细胞在气道内的富集。Seyedrazavi等[10]在对比了哮喘患者与正常人的支气管肺泡灌洗液后发现，哮喘患者肺泡灌洗液的IFN-γ的水平明显低于正常人。故本研究选取具有代表性的IFN-γ，考虑研究个体细胞因子存在浓度及时间差异，故设计了浓度依赖性实验及时间依赖性实验。本研究结果显示：IFN-γ刺激浓度和刺激时间的变化可以直接影响到ADAM33基因的表达，并且本研究中发现ADAM33基因的表达情况与IFN-γ的刺激浓度有一定的相关性，但是与IFN-γ的刺激时间的长短无关联。Ito等[11]通过支气管活检标本进行研究发现ADAM33mRNA的表达量减少依赖时间及浓度，与本研究结果一致。此外，还有一些关于ADAM33与其他细胞因子的研究，诸如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-33等，上述研究均提示辅助细胞因子参与哮喘的发生、发展，且影响着ADAM33基因的表达[8,12-17]。

通过本研究证实IFN-γ可下调气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因的表达，ADAM33参与了哮喘的血管重塑，那么IFN-γ通过什么通路或途径影响ADAM33的表达，需要进一步的研究来证实。