转色期乙醇与氯化钙处理对‘克瑞森无核'葡萄成熟特性及品质的影响

石美 贾旭 张航航 彭小慧 于建娜*

（1南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)（2塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

‘克瑞森无核'葡萄又名淑女红、克里森、绯红无核，属亚欧葡萄，晚熟品种。1998年由美国加州戴维斯农学院引入中国，一般在9月下旬至10月初成熟。‘克瑞森无核'葡萄果实呈椭圆形，果皮颜色鲜亮，果肉多汁味美，具有坐果率高，抗病性强，耐储藏等优点［1]。无核葡萄在酿造葡萄酒、葡萄汁以及其他食品生产方面具有多方面用途。近年来，随着葡萄产业重心的西移，‘克瑞森无核'葡萄在新疆种植面积迅速增加。新疆阿克苏地区地属塔里木盆地，夏季酷暑干燥，昼夜温差大，年均降水量50～70 mm，白天光照充足，提供了葡萄最适宜的生长环境。由于地处偏远，加之栽培技术落后，限制了‘克瑞森无核'葡萄果实品质及产量，主要表现在果粒小，着色不佳等。加之葡萄采收期较集中，货架期短，储藏成本高，严重降低了‘克瑞森无核'葡萄在新疆的市场经济效益。

乙醇是植物天然次生代谢产物，在有氧情况下，果蔬体内含低浓度的乙醇，但在缺氧条件下乙醇能够被大量合成［1]。近几年，一些研究人员使用乙醇蒸气或浸渍处理果蔬，在采后延缓组织衰老、抑制果蔬腐烂和有效控制果实褐变方面已做了大量研究，其中包括樱桃［3]，葡萄［4]，茄子［5]，青笋［6]，苹果［7]，杨梅［8]和豌豆［9]等。不仅如此，采前乙醇喷施处理还可有效干预果实成熟［10]、提高抗氧化能力［11]、改善果实着色［12]等作用。前期研究发现，低浓度的乙醇对水果和蔬菜损害很小［5]，而乙醇对果蔬成熟的促进或抑制作用和乙醇浓度高低有关［13]。Kereamy A E［14]等人研究发现，5%乙醇采前喷施‘赤霞珠'葡萄，发现乙醇启动了UFGT基因的表达提高了花色苷的含量。钙对植物生长发育参与了必要的营养支持，且有研究发现，硼+钙在番茄幼苗时期喷施处理，在收获时与对照比显著抑制了呼吸作用，增加了细胞壁紧密度，降低乙烯的合成，保持了番茄果实的硬度并延缓了果实成熟［15]。

葡萄果实的成熟时间及采收期直接影响果实的商品价值。乙醇等非激素小分子代谢产物能够影响植物的代谢通路，但相关研究较少。为此，本文通过转色期乙醇处理‘克瑞森无核'葡萄，分析葡萄果实转色期至成熟期间各项指标动态的变化，明确采前乙醇处理对葡萄果实生理变化的影响，为进一步研究葡萄果实的成熟生理与分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在新疆阿拉尔市十二团四连一个普通葡萄园内进行。选取长势基本一致、树势健壮且无病虫害的3年生‘克瑞森无核'葡萄为试材。按常规栽培模式进行栽培管理，葡萄篱架式栽培，栽培株行距为0.5 m×6 m，每株留果穗数为30～40串，整形修剪与肥水管理等其它栽培同常规管理。

1.2 仪器与设备

精密电子天平（BS323S，北京塞多利斯仪器系统有限公司），紫外分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司），质构仪（TMS-PRO，Food Technology Corporation）；色差仪（MinoltaCR-400，日本），糖酸一体机（PAL-BX|ACID，日本），-80℃超低温冰箱（MDF-U54V上海松下健康医疗器械有限公司）

1.3 试验处理

试验共设 4个处理：分别是TC1：1%氯化钙（CaCl2）、TC2：15% 乙醇（EtOH）中溶入 1% 氯化钙（CaCl2）、TC3：15%乙醇（EtOH）、CCK（对照）：清水喷施。

在葡萄果实转色期（2017年8月7日）进行乙醇喷施处理。每个处理喷施5株葡萄，重复喷施3次。在果实生长区用手持喷雾器进行喷施。处理后从2017年8月8日开始定期取样，直至葡萄成熟结束（9月26日），每7天采一次样，共采样8次。采样时从各处理葡萄株的上、中、下三个部位的5～6个的果穗上采摘大小均匀的60粒果实，立即带回实验室随即选取30粒果实进行相关生理指标测定，其余30粒果实于保鲜袋中放置在-80℃冰箱冷冻储藏。

1.4 测定方法

1.4.1 单果重、果粒纵横经、可溶性固形物含量（TSS）、可滴定酸含量（TA）的测定

定期取样后，立即将60粒果实样品带回实验室进行单果重、果实纵横经、可溶性固形物含量（TSS）、可滴定酸（TA）含量的测定。每个处理随机选取30粒果实测定平均单果重量，同时用游标卡尺测定各处理果实平均纵横径。用手动榨汁机挤出果实汁液混合后用糖酸一体机测定可溶性固形物含量和可滴定酸含量。

1.4.2 葡萄果皮总酚含量

参照赵雪［16]等方法，将7 g葡萄果皮浸入到20 mL甲醇中，在室温条件下提取24 h，溶液轻轻移入干净容器。残渣用20 mL的甲醇溶液提取（methanol/water 80/20，v/v）4 h，溶液轻轻移入干净容器，残渣继续用20 mL的甲醇溶液提取（methanol/water 50/50，v/v）4 h，溶液再次轻轻移入其他容器。最后将所有提取液混合。

待测葡萄皮、肉样品分别取100 μL加入10 mL的试管中7 mL蒸馏水，摇匀，再加0.5 mL福林试剂，充分摇匀，1 min后，加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，混匀，最后加入0.9 mL蒸馏水。避光反应60 min后，于765 nm波长下比色，测定吸光度，每个处理重复3次。结果以没食子酸等价值表示，没食子酸标准溶液浓度为：0、50、100、150、250 和 500 mg/L。

1.4.3 果实硬度

果实硬度使用质构仪测定，采用最大量程为25 N的圆柱形探头进行TPA测试。测试参数：形变百分数为25%，两次压缩停顿时间为5 S，起始力为0.05 N，检测速度为60 mm/min。

1.4.4 果皮色泽、叶绿素含量及花青素含量

果实表面色泽使用色差仪测定，色泽度值被表示为CIEL*a*b*系统，L*值表示颜色的亮度。a*正值表示红色程度，a*负值表示绿色程度；b*正值表示黄色程度，b*负值表示蓝色程度，并通过公式hab=tan-1（b*/a*）换算为h°，每7 d测定1次。每处理用果10个，每个果实在赤道部位相对应的两个面测定2次。

花色苷和叶绿素含量测定方法均参照李灿婴［17]等人。花色苷含量的测定：称取果皮1 g，立即以1%的HCl-甲醇溶液定容于15 mL容量瓶，在黑暗条件下提取24 h（以果皮变白为准），然后用UV-1800型紫外分光光度计，分别于600 nm、530 nm（花青苷）测定吸收变化，以U1=（OD530-OD600）/g FW=0.1作为一个花青苷单位。

叶绿素含量的测定，取1 g果皮加入10 mL 80%丙酮在黑暗条件下提取24 h（以果皮变白为准），然后用UV-1800型紫外分光光度计分别于645 nm、663 nm下测吸光度，根据吸光度值计算出叶绿素总量，单位为mg/g。

1.5 统计分析

所有数据采用Excel 2016和SPSS 21.0软件进行处理，用Origin软件作图；利用Duncan新复极差法进行差异显著性分析，每组数据重复3次。

2 结果与分析

2.1 转色期乙醇与氯化钙处理对‘克瑞森无核’葡萄果实成熟期间品质相关指标的影响

2.1.1 对葡萄单果重、果实纵横径、可溶性固形物（TSS）、可滴定酸（TA）含量的影响

由图1可以看出，单果重随葡萄果实成熟不断增加。在盛花后78 d至106 d单果重呈逐渐上升趋势，盛花后113 d至126 d期间果重已趋于稳定。TC1、TC2处理的单果重在成熟期间始终高于对照组，且与对照差异显著（P＜0.05）。采收时，TC2处理果重值为5.22 g，对照为4.67 g。结果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）显著提高了单果重，促进了果实发育。

图1 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄果实成熟期间单果重的影响

随着葡萄果实不断生长发育，各处理纵、横径不断增加。由图2可以看到，TC2处理相比对照增加了果实的纵径和横径，增大了果粒大小。采收时，TC2处理与对照比达到显著水平（P＜0.05）。结果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）增加了果粒的纵、横径，促进了果实的发育（图2a、b）。

图2 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄果实成熟期间果实纵径（a）、横径(b)的影响

可溶性固形物含量（TSS）和可滴定酸含量(TA)是影响葡萄果实成熟度和风味的重要组成物质。由图3可以看出，随着‘克瑞森无核'葡萄果实成熟过程中果实内TSS含量不断增加，TA含量不断下降。

从整个成熟过程来看（图3a），各处理TSS含量与对照变化趋势一致。采收时以TC1处理TSS含量最低为21.7%，对照为23.2%，显著低于对照组（P＜0.05）。采收时，TC2处理TSS含量为22.7%，与对照无显著）差异（P＞0.05）。由图3（b）可以看到，转色期至盛花后106 d期间，TC2处理的TA含量始终高于对照组。在成熟后期（盛花后113 d～120 d），对照TA含量略高于TC2处理。采收时，对照TA含量迅速下降到最低含量为0.86%，TC2处理TA含量为1.03%，与对照比差异显著（P＜0.05）。测定结果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）处理可显著抑制采收期TA含量的下降，对TSS含量无显著影响。

图3 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄发育过程中可溶性固形物含量(a)和可滴定酸含量(b)的影响

2.1.2对葡萄果皮总酚含量的影响

酚类物质作为果实重要的次级代谢产物，具有较强的抗氧化活性，能够清除人体自由基，有较好的抗衰老作用［18]。葡萄果实酚类物质主要累积于果皮，果肉总酚含量极少。由图4可以看出，各处理的总酚含量整体上是先下降后上升的趋势。盛花后78 d至99 d期间，TC2、TC3总酚含量均显著高于对照组。成熟后期（盛花后106 d至采收）各处理的总酚含量缓慢上升。对照组总酚含量迅速累积达到最大值为58.170 mg/100 g FW，均大于处理组。采收时，以TC2处理的总酚含量最低为52.533 mg/100 g FW，显著（P＜0.05）低于对照组。实验结果表明，TC2处理显著抑制了采收期总酚含量的积累。

图4 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄发育过程中总酚含量的影响

2.1.3 对果实硬度的影响

硬度是衡量果实成熟度的一项重要指标。随着果实不断成熟，硬度逐渐下降。由图5可看出，在转色期至采收TC2处理的硬度整体高于对照组，保持了果实的硬度。TC1处理在盛花后106 d至采收期间硬度始终高于对照组，且差异显著（P＜0.05）。试验结果表明，TC1、TC2与对照比保持了果实的硬度，延缓了果实的软化。

图5 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄发育过程中果实硬度的影响

2.2 转色期乙醇与氯化钙处理对‘克瑞森无核’葡萄果实成熟期间生理特性的影响

2.2.1 对果实色泽的影响

在色差表示中，L*值表示亮度，果皮亮度越高表明果面的光洁度越高，L*值随着果实成熟而降低。由图6（a）可以看到，随着葡萄的成熟期延长，果实亮度逐渐下降。采收时，各处理L*值与对照比均无显著差异。

Hue Angle（ho）值常用来表示果实的颜色，是果实成熟最直观的表征。Hue Angle值为90时表示黄色，180时为绿色，0为红色,值越大表示果实的颜色越绿。如图6（b）所示，ho值缓慢下降，表明果实颜色逐渐转红。在盛花后92 d至106 d期间果实迅速转红，随后果实颜色趋于稳定。采收时TC1、TC2处理ho值低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。测定结果表明，各处理对葡萄果实的色泽无明显影响。

图6 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄果实发育过程中果实色泽（L＊值(a)、ho值 (b)）的影响

2.2.2 对叶绿素含量和花色苷含量的影响

成熟葡萄果皮中存在大量的花色苷。花色苷和叶绿素含量在果实色泽改变中发挥重要作用［19]。从图7(a)可以看到，叶绿素含量随着果实成熟不断降低。TC2处理在盛花后99 d至采收期间，叶绿素含量迅速降低，且低于对照及其他处理，随后含量平稳直至采收。采收时，TC2、TC3保持较高的叶绿素含量，含量分别为0.047 5 mg/g和0.046 2 mg/g，与对照（0.039 mg/g）差异显著（P＜0.05）。测定结果表明，TC2处理显著(P＜0.05)抑制了采收期叶绿素含量的下降。

如图7(b)所示，随着葡萄果实的成熟，花色苷含量不断积累，各处理与对照变化趋势一致。盛花后113 d至采收期间TC2处理始终高于对照组，采收时TC2处理花色苷含量为18.186 U/gFW，对照为20.663 U/gFW，达到显著水平（P＜0.05）。测定结果表明，TC2处理可显著（P＜0.05）抑制果实采收期花色苷含量的积累。

图7 采前乙醇和氯化钙处理对葡萄发育过程中果实叶绿素含量(a)花色苷含量(b)的影响

3 讨论与结论

有研究表明，适当浓度的外源乙醇处理可以促进或抑制果实的成熟和后熟，而乙醇对果实成熟的抑制或促进作用是受浓度影响，且随果实初始成熟度的变化而变化［20]。本试验结果表明，转色期乙醇和氯化钙处理可抑制‘克瑞森无核'葡萄果实的成熟，这可能与15%乙醇处理浓度有关。葡萄果实的大小和果重决定了果实的商品价值，钙对植物生长发育起关键性作用［21]。在本文的研究中，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）处理提高了单果重，增加了果实的纵横径，显著促进了果实发育，提高了葡萄果实产量，其原因可能是由于Ca2+刺激葡萄体内细胞分裂素的分泌量增多有关。另有研究者发现，钙离子可以通过与细胞壁内的果胶聚合物交联［22]和保护细胞膜完整性［23]。在本文中，1%氯化钙（CaCl2）处理与对照比保持了较高的硬度，这可能是由于Ca2+使得葡萄细胞壁增厚，维持了果实的硬度，从而延缓了果实的软化。

花色苷含量的积累与可溶性固形物含量变化有密切联系。当果实内的糖含量达到一定的量时，花色苷开始积累，叶绿素含量下降，果实开始上色［24]。15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）显著抑制采收期可滴定酸含量的下降，但对可溶性固形物含量无显著影响，这可能与成熟期延长有关。同时，该处理显著延缓了花色苷含量的增加和叶绿素含量降低，整体延缓了果实的成熟。Chervin C［25]等人发现，用2.5、5和10%乙醇处理会减少‘赤霞珠'葡萄果实花青素的含量，这与本试验中花色苷含量积累受到抑制结果类似。果实色泽主要受葡萄内色素含量的影响。本试验中，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）延缓了花色苷含量的积累及抑制叶绿素含量的下降，但对果实外观色泽无不良影响。

大量研究证明，果实的生长发育及成熟受果实内源激素调控［26]作用。高漫江［27]等人研究发现，葡萄果实成熟受内源激素ABA、GA3、JA共同调控作用，以及影响相关基因的差异表达。Kou L［28]等人研究发现西兰花采前喷施10 mMCaCI2，显著影响了衰老基因BoSAG12、BoGPX6、BoCAT3和BoSAG12的表达，从而提高了果实采后品质及货架期。本文已证实适当浓度的乙醇和氯化钙处理可延长‘克瑞森无核'葡萄的成熟期，其是否影响了相关内源激素的含量和相关基因的表达，还需进一步试验研究。

本试验研究结果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化钙（CaCl2）处理抑制了总酚的积累和可滴定酸含量的下降；延缓了采收期叶绿素含量的降解和花色苷含量的积累，对果实色泽无明显影响，总体延缓葡萄果实成熟进程；提高了单果重，增加了纵横径，促进了果实发育，提高了葡萄果实的品质。