常用实验小鼠感染诺如病毒后外周血免疫指标分析

李晓波，付 瑞，王 吉，王淑菁，李 威，王莎莎，秦 骁，黄宗文，贺争鸣，岳秉飞*，赵德明

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100094； 2.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 102629)

小鼠诺如病毒(murine norovirus, MNV)目前在我国的实验小鼠中有很高的感染率[1-2]，小鼠感染MNV后大多无任何临床症状，但病毒可在体内长期存在并通过粪便排毒，污染饲养环境，继而感染其他个体[3]，我国的实验动物国家标准目前还不要求对MNV进行检测，因此很多实验用的小鼠均为MNV阳性鼠。研究发现MNV感染129小鼠会致其脾中B细胞含量显著增加[4]，129小鼠为免疫功能正常小鼠，表明MNV感染会使正常小鼠免疫功能发生改变。本研究选取国内常用的KM，BALB/c，BALB/c-nu，C57BL/6及NIH等五个品系小鼠，对其感染MNV后外周血中的免疫细胞和细胞因子含量进行检测分析，以评估对小鼠免疫功能的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

五个品系的KM，BALB/c，NIH，C57BL/6及BALB/c-nu小鼠(体重分别为30～32 g,18～20 g,20～22 g,16～18 g及16～18 g)，SPF级，雌性，6周龄，每个品系各20只，购自国家啮齿类实验动物种子中心[SCXK(京)2014-0013]，动物实验于中国食品药品检定研究院屏障动物实验设施进行[SYXK(京)2017-0013]，本实验所用水、鼠料及垫料均经过灭菌处理，并按实验动物的3R原则给予人道关怀，已通过福利伦理审查[IACUC号：中检动(福)第2018(B)020号]。

1.1.2 病毒

小鼠诺如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，TCID50为10-4.625/0.1 mL，本实验室分离并保存。

1.2 主要试剂与仪器

FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD8a、PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD49b、细胞因子检测试剂盒(LEGENDplexTMMulti-Analyte Flow Assay Kit)等均为BioLegend产品；RBC Lysing Solution(10×)购自Bio-Rad。流式细胞仪(美国BD公司，型号LSRII)；离心机(德国Hettich公司，型号MIKRO 22R)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及病毒的接种

每个品系小鼠分为感染组和对照组，每组各10只，感染组灌胃感染0.2 mL MNV病毒液，对照组灌胃0.2 mL的生理盐水。分别于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天从眼周静脉采集抗凝血，动物采血前于密封容器经CO2麻醉5～8 s，每次采集大约200 μL，200 r/min离心10 min，分离血细胞及血浆。

1.3.2 免疫细胞的检测

分离得到的血细胞，加入与血浆等体积的PBS重悬，每流式管中加入100 μL，按照检测组合加入最佳反应量的荧光标记抗体，混匀后室温避光反应20 min，每管加入用去离子水稀释10倍的红细胞裂解液工作液2 mL，混匀后室温避光孵育10 min；1500 r/min离心5 min弃上清，加入PBS洗液(含1% FBS的PBS)2 mL混匀后1500 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS洗液，混匀后及时上机检测，测定总T细胞(CD3+)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、总B细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD3-CD49b+)及NK-T细胞(CD3+CD49b+)占总淋巴细胞(CD45+)的百分比。

1.3.3 细胞因子检测

反应板每孔加100 μL洗液，室温静置1 min，倒弃，拍干，将标准品和待检血浆样品用稀释液1∶2稀释，每孔加50 μL，偶联不同细胞因子捕获抗体的荧光微球，涡旋振荡30 s，每孔加25 μL，封板膜封好，铝箔纸包裹避光，于振荡器500 r/min室温孵育2 h，每孔加200 μL洗液，真空抽滤吸干，洗涤2次。每孔加生物素标记的检测抗体25 μL，封板膜封好，铝箔纸包裹避光，于振荡器500 r/min室温孵育1 h，每孔直接加入25 μL链霉亲和素-藻红素(SA-PE)，封板膜封好，铝箔纸包裹避光，于振荡器500 r/min室温孵育30 min。洗板后，每孔加150 μL洗液，振荡器重悬微球1 min，在流式细胞仪读取数据，测定IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF等13种细胞因子的含量。

1.3.4 结果分析

(1)感染组和对照组免疫细胞总体均值的比较：比较感染组和对照组感染MNV后第7、14、21、28天的总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、总B细胞、NK细胞及NK-T细胞含量的总体均值。

(2)感染组和对照组细胞因子总体均值比较：比较感染组和对照组感染MNV后第7、14、21、28天的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF共13种细胞因子的总体均值，结果以柱状图来表示。

(3)不同时间点免疫细胞百分比含量变化分析：根据感染MNV后第0、7、14、21、28天各时间点各群细胞的均值和标准差绘制曲线图，分析各免疫细胞的变化趋势。

(4)不同时间点细胞因子含量变化分析：绘制感染MNV后第0、7、14、21、28天五个时间点各细胞因子的含量均值和标准差的曲线图，分析细胞因子含量的变化趋势。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 感染组和对照组免疫细胞含量总体均值比较

KM小鼠感染组总T细胞及CD4+T细胞相比对照组均显著升高(P<0.01)，总B细胞相比对照组显著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值相比对照组显著升高(P<0.05)。CD8+T细胞、NK及NK-T细胞与对照组比差异均无统计学意义。BALB/c小鼠感染组CD8+T细胞相比对照组显著降低(P<0.05)，其余指标两组之间差异均无统计学意义。C57小鼠感染组相比对照组CD4+、CD8+T细胞均显著降低(P<0.01，P<0.05)，总B细胞显著升高(P<0.05)，其余指标差异均无统计学意义。NIH小鼠感染组总T细胞和CD8+T细胞相比对照组均显著升高(P<0.01)，总B细胞显著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值显著降低(P<0.05)，其余指标差异均无统计学意义。BALB/c-nu小鼠各群细胞差异均无统计学意义(表1)。

2.2 感染组和对照组细胞因子含量均值比较

KM小鼠感染组CXCL10的含量显著低于对照组(P<0.01)，其余细胞因子含量比较无显著统计学差异(图1A)；BALB/c小鼠IFN-γ含量感染组显著高于对照组(P<0.01)，其余细胞因子含量无显著统计学差异(图1B)；BALB/c-nu小鼠CCL2含量感染组显著高于对照组(P<0.05)，TNF-α、CXCL1及CXCL10感染组含量均显著高于对照组(P<0.01)，而IFN-β含量感染组显著低于对照组(P<0.05)，其余细胞因子含量无显著统计学差异(图1C)；C57小鼠IL-10含量感染组显著高于对照组(P<0.05)，CCL5及GM-CSF含量感染组显著低于对照组(P<0.05)，其余细胞因子含量无显著统计学差异(图1D)；NIH小鼠各细胞因子含量均无显著统计学差异(图1E)。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：BALB/c-nu小鼠；D：C57小鼠；E：NIH小鼠。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图1 不同品系小鼠感染组和对照组细胞因子含量比较Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, BALB/c-nu mice. D, C57 mice. E, NIH mice. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 1 Comparison of cytokine levels between the infection and control groups of different mouse strains

2.3 不同时间点免疫细胞百分比含量变化分析

KM小鼠感染组和对照组总T细胞、CD4+T细胞及总B细胞均在感染第7天即已产生差异(P<0.05)，感染组相较对照组总T细胞和CD4+T细胞含量升高，总B细胞含量降低，后面的三个时间点差异均比较明显(图2A)；BALB/c小鼠CD8+T细胞在第感染第7天感染组和对照组均值一致，在第14、21天感染组均值均明显低于对照组(P<0.05)，第28天两组均值无统计学差异(图2B)；C57小鼠CD4+T细胞含量感染组均值在第7天即低于对照组(P<0.05)，直到第28天差异仍明显。总B细胞虽然第7天和第14天感染组均值均高于对照组，但差值无统计学意义，第21天和第28天两组差异显著(P<0.05)。CD8+T细胞含量在第7，14天均无显著差异，到第21天感染组均值明显低于对照组，第28天差异极显著(P<0.01)(图2C)；NIH小鼠总T细胞和CD8+T细胞在第7天两组比较无统计学意义，第14天开始感染组高于对照组(P<0.05)，第21天和第28天维持稳定。总B细胞均值第7天两组比较无统计学差异，第14天及第21天感染组低于对照组(P<0.05)，第28天两组差异极显著(P<0.01)(图2D)。

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：C57小鼠；D：NIH小鼠。图2 不同时间点两组小鼠免疫细胞均值变化曲线比较Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, C57 mice. D, NIH mice.Figure 2 Comparison of the changes of mean values of immune cell levels in the two groups of mice at different time points

2.4 不同时间点细胞因子含量变化分析

KM小鼠CXCL10含量在感染第7天两组无明显差异，到第14天感染组低于对照组(P<0.05)，后面两个时间点维持稳定(图3A)；BALB小鼠IFN-γ含量在第7天虽然感染组均值高于对照组，但差异不明显(P>0.05)，至第14天差异明显(P<0.05)，第21天感染组均值降低，差异仍明显(P<0.05)，至第28天两组差异不显著(P>0.05)(图3B)；C57小鼠GM-CSF含量第7天两组无明显差异，第14天感染组均值低于对照组，但差异不明显(P>0.05)，第21天产生明显差异(P<0.05)，第28天感染组均值进一步降低，差异极显著(P<0.01)。CCL5含量第7天两组无明显差异，第14天开始感染组低于对照组(P<0.05)，第21、28天差异仍明显。IL-10含量第7天开始感染组高于对照组(P<0.05)，一直到第28天两组差异仍明显(图3C)；BALB/c-nu小鼠TNF-α含量在第7天感染组即高于对照组(P<0.05)，第14、21天差异显著(P<0.01)，第28天感染组含量降低，两组差异不明显(P>0.05)。CCL2含量在第7和14天感染组低于对照组(P<0.05)，至第21天和28天虽然感染组均值低于对照组，但两者差异不明显(P>0.05)。IFN-β两组含量在第7天开始出现差异(P<0.05)，一直持续到第28天差异仍显著(图3D)；CXCL10含量在感染第7天两组之间无差异，至第14及21天感染组高于对照组(P<0.05)，第28天虽然感染组均值高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。感染组CXCL1含量在第7天即高于对照组(P<0.05)，后续3个时间点含量维持平稳(图3E)。

3 讨论

目前分离的MNV毒株少数为急性感染株(如MNV-1株)，可在感染动物后几天被清除，大多为持续感染株(如MNV-2, MNV-3, MNV-4, CR1,等)，可在动物体内长期存在[4-8]。免疫功能健全的小鼠感染MNV无明显临床症状，但病毒可在动物体内长期存在并通过粪便向外排毒，研究发现MNV感染129小鼠会致其脾中B细胞含量显著增加，但所用毒株为急性株，同时仅检测了一个品系的小鼠(129小鼠)[4]，而我国普遍感染的是MNV慢性株，本研究所用毒株分离自国内一实验动物使用场所，属慢性株[9-10]，所研究品系包括国内常用的KM、BALB/c、BALB/c-nu、C57及NIH小鼠，研究MNV感染对不同品系小鼠免疫功能的影响。之所以选择外周血进行检测，一是由于脾中的所有淋巴细胞均直接来源于血液，一直与血液进行交换，维持着动态平衡[11]，外周血中免疫细胞及因子含量变化能较直观的反应动物的免疫状态；二是考虑到外周血可多次采集，对动物损伤较轻，可实现对同一批动物的多次检测，避免不同批动物间的差异；另外采集外周血操作简便，影响结果的因素较少。我们参考相关文献[12-13]分别于MNV感染前(第0天)及感染后的第7、14、21、28天采集外周血，同时设立同样数量的对照组，对这5个时间点两组动物的免疫细胞及细胞因子含量进行检测，一是比较两组各指标在即感染MNV后4个时间点总体均值的差异，二是绘制每个时间点(包括第0天)的均值变化曲线，分析各指标含量的变化趋势。

免疫系统通过固有免疫以及特异性免疫发挥作用，特异性免疫又包括T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫。CD3+作为成熟T淋巴细胞表面标志，其数量可间接反映机体的免疫功能水平[14]，T淋巴细胞进一步分为CD4+和CD8+细胞， CD4+T淋巴细胞可辅助T淋巴细胞转变为效应细胞，并促进B淋巴细胞转化为浆细胞及活化巨噬细胞，CD8+T淋巴细胞具有杀伤靶细胞的功能，CD4+和CD8+T淋巴细胞含量及CD4+/ CD8+比值平衡是维持机体免疫功能的关键[15]。B淋巴细胞在脾中分化成浆细胞，产生抗体，发挥体液免疫作用，CD19是B细胞表面的主要标志。NK和NK-T细胞均属于固有免疫细胞，NK细胞杀伤活性无MHC 限制，不依赖抗体，主要分布于外周血中，NK-T细胞既有T细胞受体，又有NK细胞受体，可通过分泌大量细胞因子发挥免疫调节作用，活化后具有NK细胞的细胞杀伤活性。本研究选择检测外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、总B细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD3-CD49b+)及NK-T细胞(CD3+CD49b+)百分比含量来评价MNV感染对小鼠固有免疫和特异性免疫的影响。细胞因子根据功能不同可分为干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及趋化因子等。干扰素根据其来源和结构不同可分为INF-α、INF-β和IFN-γ，分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞产生，IFN-γ主要由I型辅助性T细胞(Th1)产生，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等特性，多个研究表明，IFN是体内外抑制MNV复制所必须的[4,12,16-18]；白细胞介素由淋巴细胞、单核细胞或其他非单个核细胞产生，其中IL-1β在免疫应答和组织修复中起作用，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，能刺激集落刺激因子、血小板生长因子等的生成和促使T细胞产生IL-2。II型辅助T细胞(Th2)主要产生IL-6、IL-10，起辅助体液免疫作用[19]，IL-12由抗原提呈细胞和B细胞产生，能诱导IFN-γ产生；肿瘤坏死因子根据其来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，参与免疫应答和炎症反应[20-21]，可促进巨噬细胞和淋巴细胞活化，并对中性粒细胞有较强的活化和趋化作用[22]；根据集落刺激因子的作用范围，可将其分为粒细胞CSF(G-CSF)，巨噬细胞CSF(M-CSF)，粒细胞、巨噬细胞CSF(GM-CSF)和多能集落刺激因子。它们可促进不同发育阶段的造血干细胞增殖和分化；趋化因子在炎症反应中具有重要作用，可分为C、CC、CXC和CX3C等4个亚族，大多属CC和CXC两族[23]，前者趋化单核细胞，包括CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、MCP-2及MCP-3等，后者趋化中性粒细胞，包括CXCL1(KC)、CXCL10(IP-10)等。本研究选择INF-α、INF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、 IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、 CXCL10和GM-CSF等13种细胞因子进行检测，以期较全面评估MNV感染小鼠后各免疫细胞发挥作用的情况。

正常小鼠外周血淋巴细胞及细胞因子含量受各种因素的影响，目前还没有统一的权威数据，本研究对照组小鼠各免疫指标所测得数据均与已有报道一致[11,15,19,21]。结果显示KM小鼠感染组CD3+T细胞及CD4+T细胞含量均显著高于对照组(P值均小于0.01)，CD4+/ CD8+比值感染组显著高于对照组(P=0.048)；B细胞含量则显著低于对照组(P值小于0.01)，趋化因子CXCL10含量感染组低于对照组(P<0.01)，其他两组之间没有统计学差异，说明MNV感染会引起KM小鼠细胞免疫应答活跃来发挥抗病毒作用，B细胞比例降低可能是由于T淋巴细胞含量增加所致。BALB/c小鼠CD8+T细胞感染组低于对照组(P值小于0.05)，CD4+/ CD8+比值及其他细胞差异不明显，结合其IFN-γ含量感染组高于对照组(P<0.05)，推测BALB/c小鼠主要通过活化的辅助T细胞来抗MNV感染。与KM小鼠相反，C57小鼠感染组相比对照组CD4+T细胞(P<0.05)和CD8+T细胞(P<0.01)含量均明显降低，B细胞含量则显著升高(P<0.05)，同时IL-10含量增加(P<0.05)，IL-10可抑制单核巨噬细胞产生促炎性活性分子，并抑制T细胞参与细胞免疫应答，其高表达与免疫细胞的抑制高度有关[24]，另外感染组CCL5及GM-CSF含量均显著低于对照组(P<0.05)，推测MNV的感染可能会增强C57小鼠的体液免疫应答，同时会抑制单核细胞的活性，抑制细胞免疫应答。NIH小鼠感染组总T细胞及CD8+T细胞含量显著高于对照组(P值均小于0.01)，CD4+T细胞两组之间差异无统计学意义，CD4+/ CD8+比值显著低于对照组(P<0.05)，B细胞含量显著降低(P<0.01)，而各细胞因子两组间均无统计学差异，表明NIH小鼠可能主要通过细胞毒性T细胞(Tc)杀伤活性来抗MNV感染。BALB/c-nu小鼠为T细胞免疫缺陷小鼠，其感染组和对照组各免疫细胞含量均无显著差异，而感染组相比对照组TNF-α、CCL2、 CXCL1、CXCL10含量均显著升高(P<0.01)，推测BALB/c-nu小鼠主要通过活化巨噬细胞，分泌细胞因子趋化并激活单核细胞及中性粒细胞来发挥抗MNV效应，INF-β含量降低(P<0.05)，可能是MNV持续感染株抑制IFN-β的释放所致[25]。各品系小鼠NK及NK-T细胞的含量均无统计学差异，表明NK或NK-T细胞在抗MNV感染中未发挥明显作用。上述结果表明MNV感染对不同品系小鼠免疫指标的影响各不相同，有的指标变化甚至相反，如KM小鼠CD4细胞升高而C57小鼠降低，有的则没有变化，如BALB/c-nu小鼠各免疫细胞含量两组间均无显著差异，有报道MNV感染会加剧Mdr1a-/-小鼠炎症性肠病模型的疾病进程，而对Smad3缺陷小鼠炎症性肠病模型则无影响[26]，这可能与MNV对不同小鼠免疫系统影响不同有较大关系。尽管MNV感染对小鼠免疫指标有明显影响，所有小鼠从实验开始到结束均未观察到临床症状，体重变化也无差异(数据未显示)，但多个研究发现MNV感染会导致小鼠肝、脾、肺及肠道等组织病理学病变，肝会出现炎性细胞病灶，脾会发生红髓增生，白髓活化，严重的坏死或纤维化[26]，这可能与其引起的免疫应答有关。

对总体均值有差异的各指标绘制各时间点的变化曲线，分析发现不同品系小鼠在感染MNV后各免疫指标随时间变化的规律有所不同，KM小鼠在感染第7天两组均值即产生显著差异，一直持续到第28天差异仍显著，说明KM小鼠免疫系统对MNV感染应答较快且更持久。BALB/c及BALB/c-nu小鼠各指标大多在第7天无显著差异，第14，21天均有显著差异，至第28天感染组均值恢复正常，两组差异不显著，此时动物体内仍存在病毒(数据未显示)，表明这两个品系小鼠对MNV感染的免疫应答持续时间较短，推测MNV更易在这两个品系形成潜伏感染。C57和NIH小鼠各免疫指标大多在感染MNV第14天才出现显著差异，直到第28天差异仍显著，我们没有进行更长时间的比较，推测两组均值的差异仍可维持一段时间。总体来说，MNV感染对BALB/c及BALB/c-nu小鼠免疫功能影响时间较短，对KM、C57及NIH小鼠影响时间相对较久。

机体的免疫系统非常复杂，要更全面的了解MNV感染对动物免疫功能的影响，还需进一步的研究。由于实验条件的限制，本研究未进行MNV急性株的比较分析，需要进行后续实验研究补充。总之，本研究的结果表明MNV的感染会对常用小鼠的免疫功能造成一定的影响，而且不同品系的动物影响也不同，建议在进行免疫相关的动物实验如药效评价、疫苗评价时选择MNV阴性小鼠，以避免实验结果出现偏差。