一株牛流行热病毒的分离与鉴定

楚会萌　任亚初　程凯慧　蒋仁新　张云飞　解晓莉　张亮　杨宏军

摘要：牛流行热病毒（ BFFV）是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一，给奶牛业的发展造成严重危害。本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测，选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠，7日后乳鼠死亡，鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带，乳鼠颅内重复接种3次，乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种BHK-21细胞，盲传3代后出现明显细胞病变，特异性引物扩增获得目的条带，测序结果与牛流行热病毒序列一致，表明成功分离到一株牛流行热病毒。

关键词：牛流行热病毒;分离与鉴定;BHK - 21细胞;细胞病变

Isolation and Identification of a Bovine Ephemeral Fever VirusChu Huimeng， Ren Yachu， Cheng Kaihui， Jiang Renxin，Zhang Yunfei， Xie Xiaoli， Zhang Liang， Yang Hongjun

Abstract Bovine ephemeral fever virus is one of the most pathogens leading to the bovine ephemeral fe-ver worldwide， which has caused serious harm to the development of dairy industry. In this study， the antico-agulant sample of suspected bovine ephemeral fever from Henan were tested by RT - PCR， then positive sam-ples was inoculated intracerebrally into sucking mice with 3 days of age. After 7 days， the suckling mice died.The target band of BFFV was identified by PCR from rat brain. After repeated intracranial inoculation for 3times， the death time of sucking mice were significantly advanced. Followed by inoculation of positive samplesinto BHK -21 monolayer cells， the CPE was obvious after three blind inoculation. The target band were ob-tained with the specific primers， and the sequencing was consistent with the bovine ephemeral fever sequence.The results showed that a bovine ephemeral fever virus was successfully isolated.

Keywords Bovine ephemeral fever virus; Isolation and identification; BHK -21 cell; Cytopathy

牛流行热（ bovine ephemeral fever，BEF）又名牛暂时热、牛三日热，是由牛流行热病毒（Bovineephemeral fever virus，BEFV）引起的一種牛急性热性传染病[1]。BEFV属于弹状病毒科（Rhabdoviri-dae）暂时热病毒属（Ephemerovims），为单股负链RNA病毒，有囊膜，目前只有一种血清型[2]。1867年，该病在东非地区首次发现，随后在非洲、亚洲和澳大利亚等多个国家和地区流行[3]。1934年，我国江苏省首次报道牛流行热的爆发，1955年以后，大部分省份都有牛流行热发病的报道[4]。牛流行热的临床典型症状为发热，感染牛体温可以升至40℃以上，其他临床表现包括气短、心率快、眼溢、结膜充血、跛行甚至卧地不起等[5]。期间乳产量明显降低，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。2014年农业部印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》将牛流行热列为重点防控疫病[6]。本实验室从牛场采集疑似患牛流行热的奶牛抗凝血[7]，进行病原分离鉴定，最终证明实验室本次分离到的毒株为牛流行热病毒。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1. 1.1 病料 病牛临床表现为持续几天体温40℃以上，眼鼻分泌物增多，食欲不振，病牛久卧不起，产奶量明显下降。抽取病牛抗凝血，置于-4℃保存，以备检测。

1.1.2 试验细胞与动物 BHK-21细胞，由山东省农业科学院奶牛研究中心牛病研究室保存，按常规方法传代培养。3日龄乳鼠，购自山东大学实验动物中心。

1.1.3 培养基及试剂 病毒基因组RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;反转录试剂盒购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司;DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司;新生犊牛血清购自美国赛默飞公司;Ea.sy Taq PCRSuperMix购自北京全式金生物技术有限公司;其他各种试剂、药品均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank上公布的BE-FV参考序列设计引物BEFV-F和BEFV-R（表1），由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 BEFV鉴定 将病牛发热期抗凝血样品分装至2mL离心管中，取200μL样品参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取BEFV病毒基因组RNA，然后按反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板、BEFV -F和BEFV -R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：12.5μL Mix，8.5μL ddH20，1μL BEFV -F，1μL BEFV -R，2μL模板cDNA。PCR扩增程序为：95℃ 10 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1min，共30个循环;72℃10 min，4℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结束后置于照胶仪中在紫外灯下观察荧光并拍照记录。将阳性扩增产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI进行BLAST同源性比较。

1.2.3 牛流行热病毒接种乳鼠脑组织 将10只3日龄乳鼠随机分组，其中8只为试验组，2只为对照组。试验组接种100μ1抗凝血至乳鼠颅内，对照组接种100μL无菌生理盐水。接种位置为乳鼠左耳右眼连接线与右耳左眼连接线的交点处，也可选择左耳左眼连接线中点或另一侧中点，确保注射人乳鼠颅内。约7日后，对照组乳鼠发育较好并有毛发生出，试验组乳鼠发育较差，并相继死亡。

取出乳鼠脑组织，用1mL生理盐水稀释相应样本，研磨后振荡混匀，反复冻融3次。将反复冻融后样本5000 r/min离心5min，取200 μL上清，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取BEFV病毒RNA，然后进行RT - PCR鉴定BEFV是否接种成功。

另选10只乳鼠重复试验，试验组接种100μL处理后阳性样品至乳鼠颅内，对照组接种100μL无菌生理盐水。正常喂养情况下，5日左右，试验组相继死亡，取鼠脑样本进行PCR鉴定。鉴定为阳性的样品进行第三次接种乳鼠脑组织，3日左右试验组死亡。然后将死亡小鼠无菌解剖，采集乳鼠脑进行PCR -琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 牛流行热病毒的分离鉴定

（1）样本处理：将第三次接种乳鼠脑组织的BEFV样本反复冻融3次，5000 r/min离心5 min取上清，在生物安全柜中用0.22μm滤膜过滤除菌。

（2）细胞接种牛流行热病毒：选取汇合度约80%的单层BHK - 21细胞，弃去生长液，用PBS清洗细胞两次，接种处理好的乳鼠脑组织BEFV病毒样本上清液1 mL，置于37℃、5% CO2細胞培养箱中吸附培养，期间每隔15min晃动细胞数次。吸附th后弃去上清液，PBS洗两遍，再向培养皿中加入含2% FBS的DMEM维持培养基，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每12 h观察细胞病变（CPE）情况，连续观察7d。出现病变的细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，5000 r/min离心5min后用病毒液再接种细胞;没有出现CPE的细胞进行盲传，盲传到第3代仍没有出现CPE，视为阴性。

（3）牛流行热病毒的鉴定：取200μL病变细胞培养液，采用病毒基因组提取试剂盒提取RNA，然后利用反转录试剂盒反转录为cDNA，用BEFV - F/R为引物，进行PCR检测。方法同

1.2.2，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定结果

提取24份发热期病牛抗凝血样品总RNA，随后反转录为cDNA，经BEFV鉴定引物BEFV -F/R扩增到约420 bp的片段（图1）。测序结果对比牛流行热病毒全基因组核酸序列，可确定该病毒为BEFV。最终从24个检测样品中共检测出5个BEFV阳性。

2.2 病毒分离鉴定结果

将初步鉴定BEFV阳性的抗凝血处理后，颅内接种3日龄乳鼠，接种1周后出现抽搐等神经症状，反复接种3次后乳鼠出现神经症状的时间明显缩短到3—4d，死亡时间提前，说明BEFV经过乳鼠脑内接种后病毒滴度增高。

将接种乳鼠脑组织后的病毒接种BHK - 21细胞，传至3代后出现明显的细胞病变，传至7代细胞CPE明显（图2）。提取接毒细胞上清液的总RNA，以BEFV - F/R为引物扩增到约420 bp的条带，与预期相符（图3）。测序结果对比牛流行热病毒全基因组核酸序列，可确定该病毒为BEFV。

3 讨论与结论

牛流行热主要发病于奶牛、黄牛和水牛[8，9]。临床上主要表现为高热、眼鼻分泌物增多、食欲不振、肌肉僵硬、跛行、久卧不起，还可造成泌乳奶牛泌乳量下降，影响肉牛肉质，严重时可导致牛只死亡，给患病牛场造成重大经济损失[10]。该病主要流行于大洋洲、非洲、亚洲及中东的40多个国家。在我国的20多个省市均有牛流行热的报道[ll]。有报道表明，牛感染牛流行热病毒后在血浆中可检测到该病毒[12.13]。本实验室通过RT-PCR方法，从发病牛外周血中扩增出牛流行热病毒特异性DNA条带，证实了发热期病牛血中含有牛流行热病毒。将初步鉴定BEFV阳性抗凝血处理后，颅内接种3日龄乳鼠，接种1周后出现神经症状，反复接种3次后乳鼠出现神经症状的时间明显缩短到3—4d，死亡时间提前，说明接种乳鼠脑组织后病毒滴度增高。将病毒接种BHK-21细胞，传至3代后出现明显的细胞病变，利用BHK-21细胞分离病毒技术可获得纯种牛流行热病毒。

近年来，牛流行热在我国多地爆发流行，并且具有明显的季节性，多发生于6-9月，流行迅猛，短期内可使大批牛只发病。该病呈周期性的地方流行或大流行，约3—5年大流行一次，大流行之后，常有一次小流行，且南方发病时间早于北方。每次疫情发病期也逐渐延长，临床表现也比过去严重，对奶牛厂和肉牛场的经济效益产生巨大的影响[14]。目前，市场上缺乏有效的防控措施和牛流行热疫苗，该病毒株的分离鉴定为牛流热新型诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。

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