革兰氏染色法观察与区分细菌

谭 啸 章熙东

(1 河海大学环境学院浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室 南京 210098； 2 江苏省南京外国语学校 南京 210008)

问题来源于生产与生活，知识运用于探索与实践，基于真实情境下的生物学教学能让学生接触实际问题，了解真实现象，有效提升学生的生物学学科核心素养。在高中生物学教材中，细菌作为原核生物的代表被重点提及，作为影响人类健康的一些病原体也被学生所认知。于是在“利用显微镜观察细胞”的实验课中，学生观察了诸如“草履虫、黑藻、口腔上皮”等常见细胞后，有学生提出： 能否观察细菌细胞，了解它们的真面目？因此，笔者推荐开展“革兰氏染色法观察与区分细菌”的实验教学。

革兰氏染色法是丹麦医生C. Gram在1884年最先发明的。几年后，德国病理学家C. Weighert改进并加入了番红复染的步骤[1]。如今，革兰氏染色法成为常见的微生物鉴别方法，细菌个体微小、结构简单，通常呈透明状态，未经染色的细菌在光学显微镜下难以观察和区分。经革兰氏染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察细菌的形态、细胞排列方式及某些结构特征，还可以用于细菌分类鉴定。

1 染色原理

革兰氏染色法的原理解释主要有三种： 等电点学说、化学学说、渗透学说。

等电点学说关注不同细菌的等电点差异，细菌的等电点在pH为2～5，在中性环境中，菌体带负电，很容易与碱性染料结合(如结晶紫、甲基紫、以及教材经常提及的龙胆紫)，并且阳性菌的等电点(2～3)通常比阴性菌(4～5)低，媒染的碘液为弱氧化剂，可以降低阳性菌的等电点，使两者等电点差异扩大。因而，初染的结晶紫与阳性菌的结合力比阴性菌强，不易被乙醇洗脱[2]。

化学学说关注革兰氏阳性菌体内含有的核糖核酸镁盐-蛋白复合物。在初染和媒染后，核糖核酸镁盐-蛋白复合物、结晶紫、碘液三者在阳性菌细胞内结合，此结合物不易被乙醇洗脱。所以，阳性菌呈紫色。而阴性菌细胞内缺乏核糖核酸镁盐，碘与结晶紫的胞内摄入量少，并且不能牢固结合，易被乙醇洗脱。

渗透学说关注细菌细胞壁成分与结构。革兰氏阳性菌细胞壁厚(约20～80 nm)，结构较简单，主要含肽聚糖和磷壁酸；革兰氏阴性菌细胞壁薄(约10 nm)，结构复杂，分外壁层和内壁层，外壁层又分三层： 最外层是脂多糖，中间是磷脂层，内层是脂蛋白。内壁含肽聚糖(含量低，结构松散)，不含磷壁酸。细菌在结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了碘与结晶紫的复合物，阳性菌由于细胞壁较厚、脂类含量低，肽聚糖网状结构交联致密，因而在乙醇脱色时，细胞因失水使网孔收缩，结晶紫与碘复合物滞留在壁内，细胞呈紫色。而阴性菌细胞壁薄且类脂含量高、肽聚糖含量低且交联松散。在乙醇脱色时，含脂层迅速溶解，结晶紫与碘复合物很容易从薄而松散的结构中洗脱，再经红色染料复染后，阴性菌就呈红色。

20世纪60年代，Salton曾提出细菌细胞壁在革兰氏染色中的重要作用[3]。1983年，Beveridge等[4]用铂代替媒染剂碘液，再用电子显微镜观察到结晶紫与铂复合物可被阳性菌的细胞壁阻留，进一步证明了由于细胞壁化学成分的差异而引起染色反应的不同，渗透学说具有较强的说服力[5]。

2 实验步骤与注意事项

革兰氏染色需要用到的试剂及配制过程如下[1]： ①结晶紫试剂： 结晶紫2 g，草酸铵0.8 g， 95%乙醇20 mL，蒸馏水80 mL。先将结晶紫溶于乙醇，草酸铵溶于蒸馏水，然后将两个溶液混匀置于密闭的棕色瓶，静置48 h后使用。②碘液： 碘化钾2 g，碘1 g，蒸馏水100 mL。为使碘充分溶解，应先溶解碘化钾，再将碘溶于碘化钾溶液。③番红试剂： 番红2.5 g，溶于100 mL 95%乙醇，取10 mL番红乙醇溶液溶于80 mL蒸馏水，摇匀。

革兰氏染色的各步骤中，脱色是最重要且最难把握的步骤。各步骤注意事项如表1。

3 “三步法”革兰氏染色

上世纪末，出现了“三步法”革兰氏染色。黄元桐等[8]把酒精脱色与复染的两步合并，减少操作步骤、缩短时间、提高了效率。后来，洪庆华等[9]用0.4%碱性品红乙醇溶液作为复染剂，可以达到脱色和复染双重效果，结果准确率高、重复性好。在教学中，为方便学生操作，提高实验效率，可以引入“三步法”的革兰氏染色。

4 常见问题与分析

以下是革兰氏染色实验教学中常见的问题和原因分析：

表1 革兰氏染色的注意事项

(1) 刚接种的细菌细胞浓度低且一些生理特征未完全表现，老龄的革兰氏阳性菌由于衰亡或自溶导致细胞壁通透性改变而出现假阴性，应在细菌的对数生长期进行染色。

(2) 涂片不宜过厚，以免脱色不充分，造成假阳性。

(3) 成败的关键步骤是乙醇脱色。如果脱色过度，阳性菌可被误认为阴性菌；如果脱色不足，阴性菌会被误认为阳性菌。

(4) 染色过程中切勿使载玻片上的染色液干涸，否则会形成染色液结晶颗粒，影响观察。

(5) 用水冲洗后，应轻轻吸去残水，避免复染液被稀释而影响效果。

(6) 阳性菌的等电点比阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌细胞会吸附更多的碱性染料，不易脱去，而阴性菌则相反。所以，不能忽视染色时pH的影响。例如，在碱性条件，两类菌吸附的碱性染料都多，可能都呈现阳性反应；在酸性条件，可能都呈阴性反应。

(7) 如果对未知菌的染色结果没把握，可在同一块载玻片上涂上与未知菌形态差异较大的已知细菌作为对照(如： 枯草芽孢杆菌或大肠杆菌)，这样可以判断染色结果的正确性和可靠性。

5 常见的革兰氏阳性菌与阴性菌

革兰氏染色法不仅可以鉴别真细菌，还可以用于鉴别古菌、真菌、蓝细菌等。所有的放线菌和真菌，有芽孢的杆菌和大多数球菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、肺炎双球菌(Streptococcuspneumoniae)等都呈革兰氏阳性反应。蓝细菌、弧菌、螺旋体、多数致病性的无芽孢杆菌都呈现革兰氏阴性反应，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、痢疾杆菌(ShigellaCastellani)、伤寒杆菌(Salmonellaenterica)、变形杆菌(Proteusspecies)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)等。致病菌仅仅作为知识内容进行了解，在教学实验操作中应避免涉及致病菌，在对环境样品的分析中也要加强安全防护。