超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定榛子中乙烯利的残留

赵立苹 林 芳

（通标标准技术服务（上海）有限公司 上海 200233）

1 前言

乙烯利作为植物生长调节剂，具有植物激素促进乳液分泌，加速成熟、脱落、衰老及促进开花的生理效应。一定条件下，乙烯利不仅能释放出乙烯，还能诱导植株产生乙烯，被广泛运用在农业种植和生产方面，可以促进果实成熟、植株矮化、提高产量。乙烯利不仅对人体的皮肤、眼睛有刺激作用，对粘膜有酸蚀作用，同时也可对水体造成污染。过量乙烯利被食用后可加速消化道衰老，造成消化道溃疡，对大脑和肾脏也有一定的损害。GB 2763—2016《食品安全标准 食品中农药最大残留限量》[1]中对谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、干制水果、坚果和调味料都规定了乙烯利的最大残留量（MRL）。

乙烯利是一种极性较强的化合物，食品中乙烯利的检残留测方法主要有气相色谱法[2,3]、离子色谱法[4-6]、液相色谱-串联质谱法[7-9]。气相色谱法中需要用到重氮甲烷甲基化试剂，操作要求较高且不方便，离子色谱法和液质联用研究对象集中在水果和蔬菜方面，针对坚果类样品研究较少。本文建立了一种超高效液相色谱串联质谱法测试榛子中乙烯利的残留研究方法，该方法操作简单，可用于批量样品中乙烯利的残留检测，为坚果类样品的研究提供了方便。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪（Waters ACQUITY UPLC H-Class，Xevo TQ-s micro 型三重四级杆串联质谱仪）；SF-TGL-16M 型高速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；XW-80A 型漩涡器（上海青浦沪西仪器厂）；WS-150D 型振荡摇床（德国 WIGGENS 公司）；950DAE 超声仪（美国 ETL TESTING 公司）；DC24H-RT 型氮气浓缩仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；JA2003A 型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；Milli-Q 型超纯水仪（密里博中国有限公司）。OASIS WAX（3cc，60 mg，美国 Waters 公司）；针式聚四氟乙烯滤膜:0.45 μm（天津市津腾实验设备有限公司）100 μL、1 000 μL 移液枪（德国 eppendorf 公司）。

乙烯利标准品（CAS No.16672-87-0，纯度97.0%，AccuStandard）；Formic acid 甲酸（HPLC 级，美国 DiKMA公司，纯度 99.0%）；Methanol 甲醇（HPLC 级，美国DiKMA 公司，纯度 99.9 %）；Acetonitrile 乙腈（HPLC级，美国 DiKMA 公司，纯度 99.9%）；Acetone 丙酮（HPLC 级，上海 ANPEL 公司，纯度 99.5%）；Ammonium hydroxide 氨水（AR 级，上海凌峰化学试剂有限公司）；实验用水均为一级水，符合相关国家要求。

精确称取乙烯利标品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成含乙烯利1.0 mg/mL的溶液，用甲醇逐级稀释标准储备液至1.0 μg/mL。分别准确移取 50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 和500 μL 1.0 μg/mL 于 10 mL 容量瓶中，用 0.1%甲酸水定容至刻度，摇匀，配制成 5 μL、10μL、15 μL、20 μL和50 μg/L 的系列标准曲线溶液。

2.2 仪器条件

2.2.1 液相色谱条件

2.2.2 质谱条件

电离模式:电喷雾正离子源模式（ESI+）；多反应监测（MRM）；脱溶剂温度:500℃；脱溶剂气流速:1 000 L/Hr；毛细管电压:3.0 kV；离子源温度:150℃；孔电压:36.0 V；驻留时间:0.054 s；监测离子对分别为 m/z145＞91、m/z145＞81，2 者的碰撞能分别为 12 V和 18 V，其中，m/z145＞91 为定量离子。

2.3 实验步骤

榛子去壳，粉碎，混匀，称取1.0 g（精确至0.01 g）榛子于50 mL 离心管中，加入40 mL 0.1%甲酸水摇匀，超声提取30 min，10 000 rpm 离心 2 min。准确移取 2 mL 上清液过 WAX 柱（3 cc，60 mg，使用前用3 mL 甲醇，3 mL 水活化），上样后分别用 3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，最后用5 mL 10%氨化甲醇进行洗脱，收集洗脱液，在40°C 下氮吹洗脱液至干，用2 mL 0.1%甲酸-水溶液复溶，过0.45 μm 滤膜，上机测试。

3 结果和讨论

3.1 质谱条件的选择

对1 mg/L 的乙烯利标准溶液在不接色谱柱的条件下，用电喷雾正离子模式（ESI+）进行母离子全扫描，确定乙烯利正离子模式的[M+H]+为m/z145；利用手动优化模式对子离子、孔电压和碰撞能等参数进行优化，确认优化后的参数为m/z145＞91、m/z 145＞81 时，2 个离子对信号最强。根据优化后的最佳质谱条件建立ESI（+）的多反应监测方法。

3.2 流动相的选择

表1 0.01 ng 乙烯利在不同流动相的响应值及信噪比（S/N）

3.3 前处理方式的选择

3.3.1 提取溶液的选择

因乙烯利极性较强，所以选择了极性较强的溶剂作为提取液，研究了10%丙酮-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-甲醇/水（1：1）、甲醇:水（1：1）对加标样品（添加量为 0.2 mg/kg）的提取效率。结果表明，在4 种提取液种采用0.1%甲酸水溶液的提取效率最高，确定提取液为0.1%甲酸水溶液，详见表2。

3.3.2 WAX 净化柱洗脱液的优化

乙烯利是一种极性较强的弱阴离子化合物，选用OASIS WAX 弱阴离子交换SPE 柱子进行净化。本实验优化氨化甲醇溶液中氨水浓度及洗脱体积。对样品中添加了乙烯利 0.2 mg/kg，做 1%、5%和10%氨化甲醇浓度水平分别在洗脱2.0 mL、5.0 mL和10.0mL 洗脱溶剂的交叉试验，以回收率表示。选择出最优的净化洗脱条件（表3）。由表3可知，采用5 mL 10%氨化甲醇作为洗脱液体积时，可得到预期的洗脱效果，所以确定采用5 mL 10%氨化甲醇作为洗脱溶剂。

表2 乙烯利添加量0.2 mg/kg 时不同提取液的提取率

表3 0.2 mg/kg 加标在不同氨化甲醇中浓度用不同洗脱体积条件的回收率（%）

3.4 线性范围和方法的检出限

将配制 5μg/L、10μg/L、15 μg/L、20 μg/L 和 50 μg/L的系列标准曲线溶液注入超高效液相色谱串联质谱仪测试，以峰面积对乙烯利的质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。

参考GB/T 27417—2017 《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[10]中空白偏差法评估方法检出限和定量限。具体操作如下:分别在10 个空白样品中加入乙烯利标准溶液，制成含有5 μg/L 的样品溶液，分别注入超高效液相色谱串联质谱仪测试，得乙烯利含量，计算乙烯利含量的3 倍标准偏差即为方法检出限，10 倍标准偏差即为方法定量限，结果详见表4。由表4可知，乙烯利在 5～50 μg/L 时，标注曲线的相关系数r 大于0.995，方法的检出限为0.04 mg/kg，定量限为0.13 mg/kg。

3.5 准确度和精密度

在榛子样品进行乙烯利标准溶液的加标回收实验，加标水平分别为 0.2 mg/kg、0.4 mg/kg 和 1.0 mg/kg，采用相应处理方法对样品进行处理，每个添加水平重复测定6 次，乙烯利在榛子样品中的加标回收率及相对标准偏差详见表5。由表5可知，乙烯利在榛子样品中的回收率为90.0%～102.0%，RSD 为4.9%～8.2%，可以满足定量分析的要求，说明所建立的方法是可行的。

表4 乙烯利的线性范围、相关系数、检出限（LOD）和定量限（LOQ）

表5 榛子样品中不同浓度水平乙烯利的回收率和精密度（RSD）

4 结语

本文采用0.1%甲酸水溶液作为提取剂，经WAX柱净化，采用超高效液相色谱串联质谱法测试，建立了榛子坚果样品中乙烯利残留的检测法方法。该方法操作简便，C18 分析柱更方便实验室的日常操作，具有提取溶剂环保，对环境污染小，回收率好，精密度高等特点，适用于坚果中乙烯利残留的检测。