脾脏酪氨酸激酶和核因子-κB对新城疫病毒-血凝素-神经氨酸酶上调自然杀伤细胞TRAIL蛋白表达的影响▲

钟伟娟 梁 莹 宋德志 田雯钰 赖振屏 樊晓晖

(广西医科大学基础医学院微生物教研室，南宁市 530021，电子邮箱：3230390976@qq.com)

作为肿瘤生物治疗的候选病毒株，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)具有几乎无毒的安全优势和显著的抑瘤效果。NDV不仅可直接诱发肿瘤细胞的凋亡和自噬，还可以通过激活机体抗瘤免疫应答来清除肿瘤细胞[1-2]。研究表明，自然杀伤(natural killer，NK)细胞的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)表达上调，是NK细胞杀伤肿瘤细胞的重要机制。NDV可通过上调TRAIL的表达来增强NK细胞的抗瘤效应[3-5]。然而，在NK细胞中介导这一过程的信号通路目前尚未清楚。我们前期研究证实在不依赖干扰素(interferon,IFN)-γ情况下，NDV经血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)途径诱导TRAIL表达来增强NK细胞的抗瘤效应；此外，信号抑制剂阻断实验结果显示，脾脏酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是TRAIL活化的重要通路分子[6]。考虑到信号抑制剂作用靶点的非唯一性，本研究用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)特异性敲低IFN-γ受体缺失的NK细胞(IFN R-/-NK)的信号分子Syk、NF-κB，进一步阐明Syk、NF-κB在TRAIL活化中的作用，为NDV抗瘤的免疫活化机制研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 NDV-HN为本实验室保存的大肠杆菌表达纯化产物。无血清RPMI-1640培养基、兔抗小鼠磷酸化IκBα单抗(批号：I1212)、兔抗鼠Syk单抗(批号：12311)、兔抗鼠TRAIL单抗(批号：E01040-1630)均购自SantaCruz公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG单抗(批号：ZS230)、兔抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体(批号：130906)均购自ZSGB-BIO公司，兔抗小鼠p65单克隆抗体(批号：B2312)购自Pierce公司，Lipofectamine 3000(批号：L3000008)、胎牛血清(批号：1828728)均购自赛默飞公司，胰酶(批号：20180625)购自索莱宝公司，MiniBEST Universal RNA盒(批号：9767/9767S)、逆转录试剂盒(批号：RR036A)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(批号：RR820A)购自TaKaRa公司，小鼠分泌型TRAIL蛋白酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号：10M22A)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定增强型试剂盒(批号：AR0146)、硝酸纤维素膜(批号：AR0135502)、电化学发光显影试剂盒(批号：12L22C)均购自Boster公司，磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline,PBS)购买自吉诺生物公司(批号：GNM20012)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：IFN R-/-NK细胞株购自赛齐生物制品有限公司，用含有链霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL)、谷氨酰胺(2 mM)、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72 h。

1.2.2 细胞分组与瞬时转染：(1)分组。用RPMI-1640培养基重悬IFN R-/-NK细胞，以2×105个细胞/孔接种于6孔细胞板，将细胞分为siRNA-Syk1组、siRNA-Syk2组、siRNA-Syk3组、siRNA-p65-1组、siRNA-p65-2组、siRNA-p65-3组、未处理组、脂质体组、siRNA-NC组。(2)瞬时转染。先把siRNA粉末配成20 pmol/μL，将5 μL siRNA(Syk1-siRNA、Syk2-siRNA、Syk3-siRNA，p65-1-siRNA、p65-2-siRNA、p65-3siRNA，厂家均为上海吉玛基因，批号：66618、66422、66423、66619、66620、66621)、3.75 μL Lipofectamine 3000和250 μL Opti-MEM培养基(Gibco公司，批号：2003808)混匀配置成转染复合物，siRNA-Syk1组、siRNA-Syk2组、siRNA-Syk3组、siRNA-p65-1组、siRNA-p65-2组、siRNA-p65-3组细胞分别加入相应的转染复合物，未处理组细胞加入相同体积的PBS，脂质体组细胞加入由Lipofectamine 3000和Opti-MEM培养基组成的转染复合物，siRNA-NC组加入由非特异性siRNA(上海吉玛基因，批号：171211)、Lipofectamine 3000和Opti-MEM培养基组成的转染复合物。siRNA序列详见表1，瞬时转染操作按照Lipofectamine 3000瞬时转染试剂盒说明书进行。36 h后，检测Syk或p65 mRNA、蛋白的表达水平。

1.2.3 敲低Syk或p65对NDV-HN作用后IFN R-/-NK细胞TRAIL蛋白表达的影响：瞬时转染16 h后，于siRNA-Syk1组、siRNA-Syk2组、siRNA-Syk3组、siRNA-p65-1组、siRNA-p65-2组、siRNA-p65-3组、脂质体和siRNA-NC组细胞中加入500 ng NDV-HN，并分别设为siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组、siRNA-p65-1+HN组、siRNA-p65-2+HN组、siRNA-p65-3+HN组、脂质体+HN和siRNA-NC+HN组，未处理组加入相同体积的PBS。继续培养20 h后，PBS洗涤两次，分别收集细胞和上清液，检测膜型和分泌型TRAIL蛋白表达水平。实验重复3次。

表1 siRNA序列

1.2.4 敲低Syk对NDV-HN作用后IFN R-/-NK细胞IκBα磷酸化的影响：瞬时转染16 h后，于siRNA-Syk1组、siRNA-Syk2组、siRNA-Syk3组、脂质体组和siRNA-NC组细胞中加入500 ng/mL NDV-HN，并分别设为siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组、脂质体+HN和siRNA-NC+HN组，未处理组加入相同体积的PBS，继续培养1 h后，PBS洗涤两次，收集细胞，测定磷酸化IκBα蛋白表达水平。

1.2.5 实时荧光定量PCR法检测Syk及p65 mRNA表达水平：提取细胞总RNA，按照MiniBEST Universal RNA提取试剂盒说明书进行操作。采用紫外光光度计鉴定RNA纯度及质量后，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录反应获得cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行实时荧光定量PCR反应。反应体系包括12 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、0.5 μL 10 μM PCR上游引物、0.5 μL 10 μM PCR下游引物、1.0 μL cDNA模板和6 μL RNase Free d H2O。反应条件：预变性94℃ 3 min、变性94℃ 30 s、退火59℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共40个循环，延伸72℃ 10 min后，于4℃终止反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，目的基因及内参基因的引物序列见表2。按照2-△△Ct方法计算Syk及p65的相对表达量，△△Ct=实验组Ct -脂质体组Ct。

表2 p65、Syk、GAPDH的引物序列

1.2.6 蛋白质印迹法检测Syk、p65、TRAIL蛋白及磷酸化IκBα水平：提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定增强型试剂盒说明书进行蛋白定量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，加样量为5 μg总蛋白，利用半干法，以100 mA恒流40 min进行电转膜，室温洗膜3次，5 min/次，用含5%脱脂牛奶和0.5%吐温20的PBS液室温封闭1 h后用PBST液洗涤3次，5 min/次，加入一抗(1 ∶1 000)，4℃孵育过夜，PBST液洗涤3次，5 min/次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1 ∶20 000)，室温孵育1 h，PBST液洗涤3次，5 min/次，采用电化学发光显影后进行灰度值扫描。其中以β-actin作为内参。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间的比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 瞬时转染后细胞Syk或p65 mRNA及蛋白表达情况 瞬时转染36 h后，siRNA-Syk1、siRNA-Syk2、siRNA-Syk3组的Syk mRNA及蛋白表达水平低于脂质体组；siRNA-p65-1、siRNA-p65-2、siRNA-p65-3 组p65 mRNA及蛋白表达水平低于脂质体(均P<0.05)。见表3～4及图1～2。

表3 瞬时转染36 h后6组细胞Syk mRNA及蛋白的相对表达水平比较(x±s)

注：与脂质体组比较，△P<0.05。

表4 瞬时转染36 h后6组细胞p65 mRNA及蛋白的相对表达水平比较(x±s)

注：与脂质体组相比，△P<0.05。

图1 瞬时转染36 h后各组细胞Syk蛋白的表达情况

注：① 未处理组；② 脂质体组；③ siRNA-NC组；④ siRNA-Syk1组；⑤ siRNA-Syk2组；⑥ siRNA-Syk3组。

图2 瞬时转染36 h后各组细胞p65蛋白的表达情况

注：① 未处理组；② 脂质体组；③ siRNA-NC组；④ siRNA-p65-1组；⑤ siRNA-p65-2组；⑥ siRNA-p65-3组。

2.2 敲低Syk或p65对NDV-HN干预IFN R-/-NK细胞TRAIL蛋白表达的影响 未处理组的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表达水平均低于其他组，siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组及siRNA-p65-1+HN组、siRNA-p65-2+HN组、siRNA-p65-3+HN组的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表达水平均低于脂质体+HN组(均P<0.05)。见图3及表5～6。

图3 各组细胞膜型TRAIL的表达情况

注：① 未处理组；② 脂质体+HN组；③ siRNA-NC+HN组；④ siRNA-Syk1+HN组；⑤ siRNA-Syk2+HN组；⑥ siRNA-Syk3+HN组；⑦ siRNA-p65-1+HN组；⑧ siRNA-p65-2+HN组；⑨ siRNA-p65-3+HN组。

注：与未处理组比较，*P<0.05；与脂质体+HN组相比，△P<0.05。

表6 敲低p65后细胞的TRAIL蛋白相对表达水平(x±s)

注：与未处理组比较，*P<0.05；与脂质体+HN组相比，△P<0.05。

2.3 敲低Syk对IκBα磷酸化的影响 未处理组磷酸化IκBα的蛋白表达水平均低于其他组，siRNA-Syk1+HN、siRNA-Syk2+HN、siRNA-Syk3+HN组磷酸化IκBα蛋白表达水平均低于脂质体+HN组(均P<0.05)。见图4及表7。

图4 各细胞的磷酸化IκBα蛋白表达情况

注：① 未处理组；② 脂质体+HN组；③ siRNA-NC+HN组；④ siRNA-Syk1+HN组；⑤ siRNA-Syk2+HN组；⑥ siRNA-Syk3+HN组。

表7 敲低Syk后6组细胞磷酸化IκBα蛋白相对表达水平(x±s)

注：与未处理组比较，*P<0.05，与脂质体+HN组相比，△P<0.05。

3 讨 论

TRAIL是肿瘤坏死因子超家族的Ⅱ型跨膜蛋白，分为膜型和分泌型。与膜型TRAIL相比，分泌型TRAIL仅为完整TRAIL蛋白C末端亲水片段的241个氨基酸，是膜型TRAIL经水解作用后的解离片段。研究表明，TRAIL的活性部位是C末端亲水片段区内，分泌型TRAIL的N端缺失并不影响其活性[6]。有学者发现，TRAIL基因的启动子存在可与NF-κB二聚体结合的κB序列，提示NF-κB可能参与TRAIL表达的信号转导[6]。

在抗肿瘤免疫应答的初始阶段，肿瘤细胞的清除需依赖于NK细胞的胞毒效应。抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、Fas配体、颗粒酶/穿孔素及TRAIL是NK细胞行使胞毒效应的主要机制。Syk属于非受体型的Syk家族成员之一，是先天免疫应答信号转导通路的重要分子。Syk不仅参与巨噬细胞和树突状细胞免疫应答启动的活化[7]，还参与NK细胞的ADCC、颗粒酶/穿孔素介导，以及TRAIL胞毒效应的触发[8-9]。我们在前期研究中发现，NDV体外刺激NK细胞后，细胞中的Syk发生磷酸化从而可上调TRAIL的表达，增强胞毒效应，而Syk信号抑制剂可以削弱这个作用[7]。因此我们认为Syk信号通路可被溶瘤病毒NDV体外活化，是NDV的抗肿瘤免疫活化的机制之一。本研究结果显示，siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组及siRNA-Syk3+HN组的膜型及分泌型TRAIL表达水平低于脂质体+HN组，即敲低Syk基因后，NDV-HN诱导NK细胞TRAIL上调的效应被削弱，且膜型和分泌型TRAIL蛋白变化趋势一致，提示在NK细胞中，Syk的信号转导对NDV-HN所致的TRAIL介导的胞毒效应具有重要作用。

我们在前期研究中还发现，NDV体外刺激NK细胞后，NK细胞中TRAIL介导的细胞毒效应显著增强，而NF-κB信号抑制剂可以削弱这个作用[10]，表明具有活性的NF-κB二聚体在NDV上调NK细胞TRAIL表达过程中起信号调控作用。也有研究表明，在NK细胞的胞毒效应启动过程中，进入细胞核识别靶基因需要转录调控元件，而具有活性的NF-κB二聚体在这个过程中起着重要作用[11-13]。p65是NF-κB二聚体的亚单位，本研究结果显示，siRNA-p65-1+HN组、siRNA-p65-2+HN组及siRNA-p65-3+HN组的膜型及分泌型蛋白均低于脂质体+HN组(P<0.05)，即敲低p65后NDV-HN上调NK细胞表达TRAIL蛋白的作用减弱，提示NF-κB信号通路在NDV体外活化NK细胞上调抗瘤效应分子TRAIL中起着信号转导的作用。

IκBα是NF-κB的负调控元件，在细胞质内，IκBα可与NF-κB二聚体发生结合，形成NF-κB-IκBα三聚体，导致NF-κB处于失活状态；当感知外界信号时，IκBα激酶被激活，致IκBα从三聚体上解离，NF-κB二聚体的核定位信号结构域被暴露，NF-κB二聚体进入细胞核内，与含有κB序列的DNA分子结合，开启该基因的转录及表达。IκBα磷酸化水平越高，进入细胞核的NF-κB二聚体就越多。本研究结果显示，siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组磷酸化IκBα的蛋白表达水平均低于脂质体+HN组(均P<0.05)，表明Syk-NF-κB可能是NDV-HN的胞内活化信号的路径，即Syk将活化信号传导给NF-κB，导致TRAIL的上调。但该结论及其具体的机制仍需进一步的实验研究验证。

综上所述，敲低Syk或p65可以削弱NDV-HN上调NK细胞表达TRAIL蛋白的作用，Syk和NF-κB信号通路可能参与NDV-HN增强NK细胞的抗瘤效应。