滑子菇多糖的结构及体外生物活性探究

陈杨扬 李 娇 王向红 李 琪 刘晓宇 桑亚新

（河北农业大学食品科技学院 河北保定071001）

滑子菇（Pholiota nameko），又名珍珠菇、真姬菇、滑菇，是一种药食兼用真菌，属真菌门、担子菌纲、伞菌目、丝膜菌科、鳞伞属[1]。 1976年我国北方由日本引进滑子菇，主要产区为河北北部、黑龙江等低温地带。 研究表明， 滑子菇多糖具有免疫调节、抗氧化[2]、抗辐射、防衰老、降脂保肝[3]等重要的生理活性。

多糖是自然界中一种含量较为丰富的高分子聚合物， 由10 个以上单糖通过糖苷键连接而成，其性质远不同于单糖。 多糖结构是多糖呈现不同生物活性的基础， 认识多糖的结构有助于更好地开发利用多糖。 多糖构效关系研究表明，多糖的单糖组成、糖苷键类型、取代基类型、分子大小等均对其生物活性有一定影响。 大多数具有突出生物活性的多糖都以（1→3）糖苷键[4-5]连接，与此同时带有一些侧链， 糖基上还连接有一些特殊的功能团。 如香菇多糖[5]主链以β-（l→3）键连接，侧链与主链间以β-（l→6）键连接，具有抗肿瘤作用及提高细胞免疫及体液免疫功能。冬虫夏草多糖[6]的单糖组成为甘露糖、半乳、葡萄糖，具有提高机体免疫，抑制肿瘤细胞的作用，并能改善化疗引起的不良反应。

机体的免疫活性细胞包括脾脏中T 淋巴细胞和B 淋巴细胞， 其增殖情况是反映细胞免疫机制最直接的指标[7]。研究发现，黑灵芝多糖[8]能有效促进脾淋巴细胞的增殖， 并能够协同ConA 和LPS促进T、B 淋巴细胞的增殖作用。 苜蓿多糖和黄芪多糖[9]在一定浓度下能显著促进淋巴细胞的增殖，表明苜蓿多糖和黄芪多糖发挥免疫作用与促进淋巴细胞增殖有关。

基于多糖类物质的构效关系鲜见研究报道。本研究探究PNP 的结构及免疫活性， 明确多糖中糖链的结构信息对于了解糖类物质在生物体内的活动行为和本质具有重要意义， 同时为活性多糖的构效研究及人工修饰提高生物活性奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滑子菇， 采摘于承德森源绿色食品有限公司平泉县养殖基地；刚果红，天津市华东试剂厂；碘，上海医药集团化学试剂公司；碘化钾，天津市凯通化学试剂有限公司；无菌小白鼠20日龄，由河北医科大学提供；RPMI-1640 培养基，Thermo 公司；无原体新生牛血清， 浙江天杭生物科技股份有限公司；刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑（MTT），北京索莱宝科技有限公司； 其他均为分析级试剂购买于天津天力公司。

1.2 试验仪器

KQ-500DE 数控超声波清洗器， 昆山市超声仪器有限公司；TGL 16M 台式高速冷冻离心机，湖南易达京华有限公司；IKA 旋转蒸发仪， 艾卡（广州）仪器设备有限公司；FD5-2.5 冷冻干燥机，SIM 科技有限公司；K5600 超微量分光光度计，北京凯奥科技发展有限公司；Spectrum 65 傅里叶红外光谱仪，美国PerkinElmer 公司；Ultrashield 400核磁共振波谱仪，BRUKER 公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台， 苏州安泰空气技术有限公司；MCO-18AC CO2培养箱，日本SANYO 三洋有限公司；YS100 显微镜，Nikon 仪器公司；1500-823 型酶标仪，Thermo Scientific 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 滑子菇多糖的提取 滑子菇洗涤干净，110℃烘干至恒重、粉碎成末，以1∶20 料液比溶于水，400 W 功率超声20 min，80 ℃热水浸提6 h 后离心取上清，Sevage 法除去蛋白（3～4 次），离心分离所得多糖溶液层进行旋蒸浓缩，3 倍体积95%乙醇进行醇沉过夜，离心、透析、冻干、经DEAESepharose Fast Flow 和Sephadex G100 纯化得到酸性滑子菇多糖PNP， 高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测其分子质量为16 202.91 u，柱前衍生HPLC 法测其单糖组成为Man∶Glu∶Gal∶Xyl=6.90% ∶22.81% ∶56.28%∶14.01%[10]。

1.3.2 滑子菇多糖的结构分析[11-12]

1.3.2.1 红外光谱分析 称取2.0 mg PNP 样品进行KBr 压片， 在4 000～400 cm-1范围内进行红外扫描，分辨率为4 cm-1。

1.3.2.2 核磁共振图谱分析1H NMR 谱： 称取纯化干燥后的PNP 样品（20 mg）， 溶解在0.5 mL重水（D2O）中，用注射器置于5 mm 核磁管中，Ultrashield 400 核磁共振仪上分析测定氢谱。

1.3.2.3 β-消除反应 取PNP 样品5 mg， 加蒸馏水5 mL，并加0.4 mol/L NaOH 溶液2.5 mL，于45 ℃水浴锅中水浴反应3 h，然后紫外光谱扫描。

1.3.2.4 刚果红试验 称取5 mg 的PNP 样品，加2.5 mL 蒸馏水溶解，并加入80 μmol/L 的刚果红试剂2.5 mL， 逐渐加入浓度为1 mol/L 的NaOH，使NaOH 在溶液中的终浓度从0 mol/L 逐渐升到0.5 mol/L， 进行紫外可见光谱扫描， 测得不同NaOH浓度下的最大吸收波长。

1.3.2.5 碘-碘化钾反应 称取2 mg PNP 样品，加蒸馏水2 mL，加入1.2 mL 的碘试剂（含0.02%I2的0.2% KI 溶液）， 混匀后进行紫外光谱扫描（300～700 nm）。

1.3.3 滑子菇多糖的生物活性探究

1.3.3.1 制备脾细胞[13-14]8～10 周龄的小鼠眼球放血，脱颈致死，于75%酒精内浸泡杀菌5 min，转移超净台内取脾脏，先用hanks 液清洗干净，后转到200 目钢网及培养皿内研磨， 直至hanks 液发白为止。然后将培养皿中悬液1 000 r/min 离心10 min，3 倍体积红细胞裂解液裂解2 min 去除红细胞，hanks 液清洗沉淀3 次，最后1 mL 含10%无支原体新生牛血清RPMI 1640 培养液重悬，离心后静置3 min。 取出上述细胞悬液0.1 mL 于小离心管中，台盼蓝染色1 min 后，血球计数板计数，调整细胞悬液浓度为5×106个/mL。 台酚蓝染色检测细胞存活率大于95%。

1.3.3.2 滑子菇多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 采用MTT 法观察PNP 对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用[15-16]。将上述制备好的脾细胞悬液，取40 μL 加入96 孔培养板中，试验随机分为空白组、模型组和多糖试验组（多糖终质量浓度分别为800，400，200，100，50 μg/mL），每组6 个复孔，其中试验组与模型组均加入8 μL ConA（终浓度为5 μg/mL）， 最后用RPMI 1640 培养液调整总体积至160 μL，96 孔培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h， 在终止培养前4 h， 各孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，置于CO2培养箱继续培养4 h 后取出，加入80 μL 甲瓒溶解剂[17]（14%SDS+50%DMF pH=4.7）培养过夜， 用酶标仪测定570 nm处吸光值并计算其增殖率，计算公式如下：

1.3.3.3 滑子菇多糖对H2O2损伤脾细胞的保护作用 按上述方法制备细胞悬液， 取40 μL 加入96 孔培养板中， 试验随机分为空白组、H2O2损伤组和多糖保护组（多糖终质量浓度分别为40，20，10，5，2.5 μg/mL），每组6 个复孔。 其中H2O2终浓度为400 μmol/L，无菌PBS 稀释，过膜除菌，最后调整96 孔板总体积至160 μL， 置于37 ℃、5%CO2培养箱中损伤2 h 后，利用MTT 法测570 nm处吸光值。 根据公式计算多糖对H2O2引起的脾细胞损伤的保护率，计算公式如下：

1.3.4 数据统计分析 利用Excel 软件对试验数据进行分析，数据以均值±标准偏差表示，试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 PNP 的结构分析

2.1.1 红外光谱测定 红外光谱（IR）是指波数为4 000～400 cm-1的中红外区，根据样品在红外区的吸收，可寻找多糖特征官能团，用于研究糖类化合物中的醛糖、酮糖的糖环构象及糖苷键的构型等。

PNP 红外光谱结果如图1 所示，3 400 cm-1是O-H 的伸缩振动峰。 2 926 cm-1的吸收是由-CH2-基团的C-H 伸缩振动引起的。 1 643 cm-1是-CHO的C=O 伸缩振动峰。1 420～1 385 cm-1的吸收峰是由于C-H 的变角振动引起的。 对于特征吸收峰出现在1 200～1 000 cm-1范围内的多糖，属于吡喃环中的伸缩振动， 其在该区域谱峰的位置和强度都具有专一性，1 072 cm-1处是糖环中C-O-C 中C=O 伸缩和变角振动引起的。 且PNP 在1 740 cm-1处无糖醛酸对应的特征吸收峰，说明PNP 多糖不含糖醛酸[18]。

2.1.2 核磁共振图谱分析核磁共振（NMR）用来判断糖类化合物的糖苷键构型、糖环构象、糖残基顺序、糖苷键位置等。多糖类物质的1H NMR 中质子信号的分布处于很窄的范围内， 而且有着复杂的偶合关系。 大多数多糖中1H 信号多集中在δ 3.2～5.5 mg/L 这个范围内。 在一般情况下，分布在δ4.3～5.5 mg/L 范围内的质子信号容易分析， 而其他区间内的信号共振容易发生重叠交叉， 难以解析。 并且δ4.3～5.5 mg/L 为异头碳质子（C1-H）共振区， 通常来说该区内有几个异头碳质子就代表有几种单糖构型。

如图2 所示是PNP 的核磁氢谱图。 PNP 在异头碳质子共振区内有5 个不同强度的共振吸收峰，化学位移分别为5.09，4.95，4.70，4.464.42 mg/L，从左至右依次标记A-E，除δ4.70 mg/L 是溶剂D2O 的残余氢峰外， 其余4 个共振吸收峰就代表了PNP 由4 种单糖组成，与之前的单糖组成测定结果相符[10]。 此外，化学位移大于δ5.0 mg/L 异头质子一般是α 型糖苷键的共振信号， 而小于δ5.0 mg/L 为β 型糖苷键。从氢谱图中可知，PNP 是由α和β 两种糖苷键构型组成， 但是异头碳上氢的化学位移只有一个大于δ5.0 mg/L， 其化学位移为δ5.09 mg/L，表明PNP 是以β 型糖苷键为主。并且在δ2.0～2.4 mg/L 没有信号吸收峰，说明PNP 不含乙酰基。

图1 PNP 红外光谱Fig.1 FT-IR spectrum of PNP

图2 PNP 核磁图谱Fig.2 1H-NMR Spectroscopy of PNP

2.1.3 β-消除反应 加入0.4 mol/L 的NaOH 与不加NaOH 溶液的滑子菇多糖溶液进行扫描结果比较，如图3 所示。

由图3 可知， 经稀碱处理后的PNP 溶液在240 nm 处吸收下降，是因为PNP 中不含有O-糖苷键，经过碱处理没有产生α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸，所以说明了PNP 中不含O-糖苷键。

2.1.4 刚果红试验 刚果红（Cnogoerd）是一种酸性染料， 能够与具有三股螺旋链构象的多糖形成络合物，之后使刚果红的最大吸收波长发生红移，在浓度一定的NaOH 范围内， 表现为最大吸收波长的特征变化（变成紫红色），当NaOH 浓度大于0.3 mol/L 之后，最大吸收波长逐渐下降。PNP 的刚果红试验最大吸收波长变化如图4 所示。

图3 经NaOH 处理前后PNP 紫外光谱Fig.3 UV spectra change of PNP treated by NaOH

图4 PNP-刚果红复合物最大吸收波长的变化Fig.4 Maximum absorption of PNP-Congo red complex in solution with various concentration of NaOH

从图4 可以看出， 刚果红溶液最大吸收波长逐渐减小， 与对照的刚果红溶液相比较，PNP+刚果红复合物的最大吸收波长上升， 可能是因为PNP 没有高度有序的螺旋结构解离， 转变成自由卷曲结构，没能使络合物的最大吸收波长下降[19]，但是当NaOH 浓度逐渐升高到0.4 mol/L 后，最大吸收波长趋于稳定，这表明PNP 中可能不存在螺旋构象。

2.1.5 碘-碘化钾反应 PNP 溶液与碘试剂混匀后进行紫外可见光谱扫描如图5 所示，PNP 与碘试剂的反应物最大吸收峰在356 nm 处，而在565 nm 处无最大吸收峰， 说明PNP 可能存在较长的侧链和较多的分枝。

2.2 PNP 对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的影响

图5 经I2-KI 处理后PNP 紫外光谱图Fig.5 UV-Vis spectrum after PNP reacted with I2-KI

2.2.1 PNP 对小鼠T 淋巴细胞增殖的影响 免疫调节系统是机体执行免疫应答的一个重要系统，淋巴细胞则是参与机体免疫应答的主要效应细胞[20]。脾脏淋巴细胞中含有T、B 淋巴细胞，它们均是机体的免疫活性细胞， 其中ConA 是T 淋巴细胞的有丝分裂原，作用于T 细胞膜上的相应受体，主要促进T 淋巴细胞的增殖。本试验PNP 对T 淋巴细胞的增值作用结果如表1 所示。

由表1 可知，PNP 协同ConA 促进了小鼠脾T淋巴细胞的增殖， 其增殖率随着多糖浓度的增加表现出先升高后降低，50，100 μg/mL 的PNP 抑制了脾淋巴细胞的增殖，200，400，800 μg/mL 的PNP不同程度地促进了T 淋巴细胞的增殖， 在多糖质量浓度为400 μg/mL 时，达到了最大增殖率5.93%。由此表明，PNP 可能作为T 淋巴细胞的有丝分裂原促进淋巴细胞的增殖进而对机体起到了免疫调节作用。

表1 PNP 对T 淋巴细胞增殖的影响Table 1 Effects of PNP on proliferation of T lymphocyet

2.2.2 PNP 对H2O2损伤细胞的保护作用 H2O2是重要的活性氧物质，极容易透过细胞膜，通过代谢作用产生大量具有细胞毒性的自由基， 从而引发脂质过氧化、DNA 损伤等， 被广泛的应用诱导细胞氧化损伤[21]。 研究发现多糖对损伤细胞的保护作用主要是因为多糖能够清除双氧水所产生的自由基[22]，本试验PNP 对H2O2损伤脾细胞的保护作用结果如表2 所示。

表2 不同浓度PNP 对细胞保护率的影响Table 2 Effects of different doses of PNP on protective percent of the cells

由表2 可知，PNP 对H2O2损伤的脾细胞具有明显的保护作用。 随着PNP 浓度的增加，保护作用逐渐增强，在一定浓度范围内存在着剂效关系，在多糖质量浓度为20 μg/mL 时，达到最大保护率54.66%。 由此可以说明，本试验PNP 是良好的自由基清除剂，可有效保护自由基存在下的细胞，避免细胞死亡及组织损伤。

3 结论

本文通过水提醇沉、Sevage 法除蛋白获得的PNP 进行了研究。结构测定结果表明，一级结构测定分析PNP 具有多糖的特征吸收峰， 是不含O-糖苷键的黏多糖， 主要以β 型糖苷键为主不含乙酰基、糖醛酸的吡喃环结构，核磁氢谱分析出PNP由4 种单糖组成。 高级结构分析PNP 可能不具有螺旋构象，但具有较长的侧链和较多的分枝构型。在体外免疫活性测定了多糖对淋巴细胞增殖以及H2O2损伤的保护作用，结果表明，PNP 对淋巴细胞有增殖作用，在多糖质量浓度为400 μg/mL 时，达到了最大增殖率5.93%，而对H2O2损伤的保护在最佳质量浓度为20 μg/mL 时， 达到最大保护率54.66%。 综上对PNP 结构及免疫活性的研究为进一步做深入构效关系机理研究奠定了基础， 对于开发免疫反应调节剂和功能性保健食品的开发提供了依据。