巴什拜羊、盘羊杂交羊重组SP-A蛋白对体外培养MO增殖的影响

赵 宁，魏春燕，王晨豫，孙延鸣

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003)

肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A)是一种亲水性的糖蛋白，其隶属于C-型凝素家族成员，是肺部的一种天然免疫防御分子，在肺中起着十分重要的局部防御和天然免疫作用[1]。SP-A在肺炎支原体聚居的支气管肺泡中特异表达，并且可与细菌、真菌、病毒结合并相互作用，已成为肺部先天免疫系统的一个特异组成部分，在呼吸系统中是抵抗病原菌的第一道防线[2]。SP-A是一种广谱调理素，它具有膜透过性和杀菌特性，并且可以改变吞噬细胞的功能及活性，改善其对病原体的摄取、杀灭[3]。SP-A可以聚集大量病原微生物，其中包含细菌、真菌、酵母、病毒及螨浸出液。一方面，SP-A凝集的微生物更易于被巨噬细胞吞噬；另一方面，SP-A直接影响微生物的生长及成活[4]。目前人们对SP-A的研究大部分集中在小鼠和人，在绵羊有关该蛋白功能的研究鲜有报道。

巴什拜羊是一种新疆的地方性优良品种，具有抗病力强的特点。盘羊体格健硕，是国家二级保护野生动物，通过与巴什拜羊杂交，其后代盘羊杂交羊生长快速，具有野生盘羊体型庞大的优点，但抗病力低下。本实验室前期通过巴什拜羊与盘羊杂交羊人工感染绵羊肺支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)比较试验，发现巴什拜羊对MO感染的抗性明显高于盘羊杂交羊[5]。为证实该结果是否与SP-A有关，本实验室前期已利用RACE技术对巴什拜羊和盘羊杂交羊的SP-A基因进行了克隆和真核表达，采用真核表达系统及镍柱层析法获得纯化的重组SP-A蛋白(rSP-A)[6]。本研究将巴什拜羊和盘羊杂交羊的rSP-A添加于MO培养液中进行体外培养，采用平板菌落计数法以及荧光定量PCR法，检测巴什拜羊和盘羊杂交羊的rSP-A蛋白是否对体外培养的MO增殖产生影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MO由石河子大学动物科技学院预防兽医实验室剡根强教授惠赠，与Y-98标准株同源性为98%；E.coliDH5α菌株由本实验室保存；质粒小量提取试剂盒、GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司；pMD18-T载体、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒SYBR Premix ExTaqTM购自TaKaRa公司；胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 培养基制备 MO培养液：采用0.22 μm滤器过滤，添加15%胎牛血清，补充1‰氨苄青霉素，保存于4℃备用。

PPLO肉汤琼脂板：PPLO肉汤粉2.1 g，葡萄糖0.5 g，低熔点琼脂粉0.7 g，溶于100 mL蒸馏水中，调整pH值为7.4，高压灭菌后待冷却至60℃时补充20 mL预热至40℃左右的胎牛血清及1‰氨苄青霉素，倾倒至直径60 mm细胞培养皿中，凝固后倒置于4℃保存，本操作均在无菌环境中进行。

1.3 平板菌落计数测定rSP-A对MO生长的影响MO培养液中接入20%体积的菌液，并于37℃、5%CO2条件下培养7 d，待培养液颜色由红变黄，调整菌液浓度为105ccu/mL[7]。实验分为4组，A、B、C组各加入两种羊的 rSP-A至终浓度为10 μg/mL、20 μg/mL 和 40 μg/mL，并补充 5 mmol/L CaCl2，对照组(D组)加入20 μL酵母提取液，与MO菌液共同培养2 h后均匀涂布在PPLO肉汤琼脂板上，37℃、5%CO2培养7 d，每组平板取9个视野，并在体式显微镜(10×目镜，2×物镜)下观察菌落形态，对单个菌落进行计数。各组重复3次，取平均值。

1.4 荧光定量PCR检测rSP-A对MO 16S rRNA转录水平的影响 采用张晓丽[7]建立的荧光定量PCR方法检测在0、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h时各组MO 16S rRNA的基因拷贝数，比较各组检测结果，分析rSP-A对MO 16S rRNA转录水平的影响。

1.5 数据处理 采用Microsoft excel 2007和DPS7.05对数据进行处理分析，采用新复极差法(Ducan)分析数据的差异显著性。

2 结果与讨论

2.1 平板菌落计数结果 MO在PPLO肉汤琼脂平板上培养一周后，肉眼可见平板上生长的支原体菌落呈现针尖状，将琼脂平板置于体视显微镜下，可观察到支原体菌落为圆形、突起的露滴状。培养基的琼脂浓度会影响MO在显微镜下的形态。当培养基的琼脂含量大于0.7%时，在体视显微镜下呈现露滴状，与冷青文[8]报道一致，当琼脂浓度小于0.7%时，则呈现油煎蛋状。A、B、C 3组分别加入不同浓度的两种羊的rSP-A与MO菌液共培养2 h后涂布于PPLO肉汤琼脂板上，对每组单个菌落计数的结果显示(图1)，加入巴什拜羊rSP-A的A、B、C组菌落数分别比对照组减少8.35%(p＞0.05)、23.04%(p＜0.05)、40.03%(p＜0.01)。加入盘羊杂交羊 rsP-A的A、B、C组与对照组相比菌落数分别减少6.73%(p＞0.05)、21.74%(p＜0.05)、37.11%(p＜0.01)。Piboonpocanun等研究显示人和大鼠rSP-A能够显著抑制肺炎支原体的生长，同时SP-A与肺炎支原体结合依赖于钙离子的存在。进一步对其抑菌机理研究，发现SP-A与肺炎支原体之间的高度亲和力依赖于膜中存在的饱和磷脂酰甘油，SP-A可以通过与肺炎支原体表面表达的脂质配体相互作用从而达到减弱肺炎支原体生长的效果[2]。本实验结果显示巴什拜羊和盘羊杂交羊rSP-A能够在体外抑制MO生长，并且随着SP-A浓度的升高，抑制MO生长的效果越显著。该结果与Piboonpocanun的研究结果相似。

2.2 MO 16S rRNA荧光定量PCR检测结果 荧光定量PCR检测后获得各样品Ct值，按照标准曲线回归方程式y=-3.3011x+41.68，R2=0.9957，计算出各实验组和对照组MO 16S rRNA基因拷贝数。结果显示：与对照组相比，两种羊的rSP-A与MO菌液共培养2 h时各实验组16S rRNA基因拷贝数均下降，且随着蛋白浓度的升高，该拷贝数越低；4 h时下降至最低，此时，加入巴什拜羊rSP-A的实验A、B、C组MO 16S rRNA基因拷贝数比对照组下降了 72.15%(p＜0.05)、78.81%(p＜0.01)。作用 4 h时，加入盘羊杂交羊rSP-A的实验A、B、C组MO 16SrRNA基因拷贝数比对照组下降了26.26%(p＞0.05)、76.62%(p＜0.01)、80.83%(p＜0.01)，8 h 后各实验组该基因拷贝数开始上升，但仍然显著低于对照组(图2、图3)。12 h、18 h、24 h各实验组该基因拷贝数继续升高，但各组之间均出现了极显著的差异，24 h时加入巴什拜羊rSP-A的实验A、B、C组MO 16S rRNA基因拷贝数与对照组相比分别下降了57.65%(p＜0.01)、74.12%(p＜0.01)、89.73%(p＜0.01)；加入盘羊杂交羊rSP-A的实验A、B、C组MO 16S rRNA基因拷贝数比对照组下降了58.7%(p＜0.01)、74.26%(p＜0.01)、88.94%(p＜0.01)。该结果表明，rSP-A能够明显抑制MO 16S rRNA的转录水平，并且rSP-A在10 μg/mL～40 μg/mL范围内呈剂量效应关系。且rSP-A对MO 16S rRNA转录水平的影响在巴什拜羊与盘羊杂交羊两个品种之间并无显著差异。

本研究从绵羊SP-A基因入手，得出了绵羊rSP-A蛋白具有抑制MO生长的生物学功能的结果。为今后研发治疗绵羊支原体肺炎的药物提供了参考依据，也为进一步研究盘羊杂交羊易感MO的分子作用机制奠定了基础。