血清4型鸡腺病毒AHHN分离株全基因组测序及其致病性研究

李允章，梅 楠，汪 凯，杨志伟,，王桂军，刘红梅*，陈鸿军*

(1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科，但其病毒属尚未确定。按照FAdV群特异性抗原不同，将FAdV属分成3个群：I群、II群和Ⅲ群FAdV，从鸡群中分离的I群FAdV(FAdV-I)被划分为A～E 5个亚群，共有12个血清型(FAdV 1-12)[1]，其中FAdV-I C亚群中有两个成员分别为FAdV-4和FAdV-10[2]。FAdV-I在全球各地频繁零星暴发，主要引起非典型病变和亚临床症状，表现为肝炎、再生障碍性贫血、出血、生产性能下降，严重的造成鸡包涵体肝炎、心包积液综合征、肌胃糜烂和溃疡等[3-4]。

自2015年以来，国内暴发了一种引起包涵体肝炎和心包积液综合征的高致病性FAdV感染，主要侵害3周龄～5周龄肉雏鸡以及10周龄～20周龄蛋鸡。该病多呈急性发病，死亡率为30%～80%，有的甚至达到100%，给养鸡业造成严重经济损失[5]。本实验室在2016年自安徽淮南某鸡场患有心包积液综合征的死亡鸡中分离获得一株初步鉴定为I群C亚群鸡腺病毒血清4型(FAdV-4)的病毒株，命名为AHHN株，本研究对其全基因组序列进行了测定和致病力分析，为阐明FAdV-I毒力增强分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.2 分离株全基因组扩增及序列分析 根据Gen-Bank中FAdV-4经典无毒力ON1株(GU88428)全基因组序列设计引物(表1)。利用基因组DNA提取试剂盒提取I群C亚群FAdV-4 AHHN株DNA为模板，采用每对引物分别进行扩增，PCR扩增片段经电泳分离后回收目的条带，由苏州金唯智公司测序，将测序获得的DNA序列采用DNAStar软件拼接获得分离株的全基因组序列，参照GenBank中相关序列对其全基因进行比对分析。

1.3 病毒致病性试验 将16只7日龄的SPF鸡分成两组，分别为病毒感染组和对照组，每组8只。感染组SPF鸡采用FAdV-4 AHHN分离株以1×105TCID50/100 μL经肌肉注射，对照组鸡经肌肉注射100 μL PBS溶液。每天观察鸡的临床症状，记录发病死亡情况，将死亡鸡剖检，采集其心、肝、脾、肺、肾、脑、气管等组织脏器。感染21 d后，迫杀剩余实验鸡，无菌操作采集上述脏器。将上述所有脏器分别研磨后，倍比稀释接种LMH，测定各脏器的平均病毒载量(TCID50/mg)。另外，取感染组死鸡和对照组鸡肝脏组织，经10%福马尔林溶液固定后用于制备病理组织切片，H&E染色后观察组织病变。

表1 FAdV-4全基因组扩增引物

2 结果与讨论

2.1 FAdV-4 AHHN分离株的全基因组测序 根据FAdV-4无毒力ON1株设计引物，分别扩增AHHN分离株的38个PCR片段，结果显示：各个PCR产物大小均与预期相符(图略)。测序后利用SeqMan软件拼接成全基因组序列，结果显示：AHHN分离株全长43 723 bp，G+C含量为54.87%(GenBank登录号为KY379035)。序列分析进一步确认分离株属于禽腺病毒C亚群血清4型(图1)，将AHHN分离株与经典无毒力株ON1的基因序列比对，AHHN分离株主要存在于以下基因和片段的缺失和变异：在结构蛋白pVI基因非编码区第19 530 nt～19 551 nt，GAGA基序长度不同，AHHN株存在10个GA序列重复，病毒株ON1为5个重复；AHHN分离株ORF19全基因缺失，ORF29基因部分区域缺失，缺失区域与JS07病毒株相同[6]。该病毒基因组其它部分与ON1株仅少数碱基存在差异。以上实验结果表明，该分离株属于FAdV-4型变异株。但部分基因的缺失是否会造成毒力增强或者减弱，这有待进一步研究论证。

2.2 FAdV-4分离株的致病性试验 AHHN分离株注射8只3周龄SPF鸡后观察发现，感染2 d后，鸡群开始发病，主要表现为精神萎靡，羽毛蓬乱，白色水样下痢；5 d内感染组的鸡全部死亡。对病死鸡剖检发现：肝脏土黄色肿大、质脆，表面有斑点状出血；心包腔积有淡黄色清亮透明渗出液；脾脏暗红色肿胀；腺胃黏膜脱落、糜烂；十二指肠黏膜脱落、出血；盲肠出血严重，肾脏肿大。选取感染组病死鸡和对照组鸡的肝组织，进行病理切片检测，结果显示：AHHN分离株感染组鸡的肝细胞排列紊乱，有灶状坏死，病变细胞核浓染，核内能见到嗜碱性包涵体，形状呈圆形或不规则形。而对照组鸡各项检查组织结构正常。病毒载量检测结果显示，感染组鸡各脏器病毒滴度均高于104TCID50/mg，其中肝脏的病毒载量最高，平均滴度达7.75×107TCID50/mg(图2)。表明FAdV-4 AHHN分离株对鸡具有高致病性及广泛的组织嗜性。

国内FAdV-I目前呈现大范围流行趋势，除了血清4型变异株，还有8型、10型等多个血清型[7]。对于高致病性FAdV-4的分子致病机制研究至今尚不深入，通过比较差异病毒株基因序列，初步分析hexon、fiber-1、fiber-2、52K、 GAGA 基 序 区 、ORF29等部分基因极可能与毒力有关。利用CRISPR-Cas9技术和同源重组等技术靶向敲除基因组片段，对于FAdV的分子致病性研究具有重要意义。本研究初步对I群C亚群FAdV-4 AHHN分离株全基因组序列进行了测定，确认其为血清4型变异株，并初步对其致病力进行分析，为阐明FAdV-I毒力增强分子机制研究奠定了基础。