美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

刘梦莹，李敏华，王 倩，田志军*，周伦江,3*

(1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点猪病实验室，黑龙江哈尔滨150069；3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)，是引起母猪发热、早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍与呼吸道疾病的传染病病原。目前国内流行的类NADC30株属于PRRSV 5亚群，主要以基因缺失和基因重组多样性为特征[1]。PRRSV的糖蛋白GP4有4个糖基化位点，这些位点突变影响PRRSV的毒力，同时GP4在病毒复制中也起重要作用[2]。有研究表明GP4是PRRSV感染及产生中和抗体的重要糖蛋白，其胞外域可能是产生中和抗体的相关位点[3]。而目前对于PRRSV具有中和活性的单克隆抗体(MAb)的制备与研究鲜有报道。本研究制备了具有中和活性的抗PRRSV GP4的MAb，为了解PRRSVGP4蛋白的结构功能具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 PRRSV SD53株(类NADC30 PRRSV株)、疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92、JXA1-R、欧洲株DV由本实验室提供；PRRSV各结构蛋白质粒(p3XFLAG-CMV-GP2、p3XFLAG-CMV-GP3、p3XFLAG-CMV-GP4、p3XFLAGCMV-GP5、p3XFLAG-CMV-M 和 p3XFLAG-CMV-N)、pGEX-6P-1、Marc-145细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、293T细胞、受体菌 TG1、Rosetta(DE3)、HPPRRSV M蛋白MAb 3F7均由本实验室构建并保存；IPTG购自北京索莱宝科技有限公司；融合剂PEG、FITC标记山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)购自Sigma公司；GST MAb购自TIANGEN公司；DyLightTM800标记的羊抗鼠IgG购自KPL公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；IgG抗体亚类鉴定试剂盒购自Thermo Fisher公司；BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司；SPF级BALB/c雌鼠购自北京维通利华公司。

1.2 PRRSV GP4蛋白MAb的制备与鉴定 将美洲型PRRSV SD53株接种于Marc-145细胞中，待细胞病变(CPE)至80%～90%后，反复冻融，将超速离心的病毒作为免疫原，按照文献[4]对小鼠免疫和细胞融合。以感染PRRSV SD53株的Marc-145细胞为抗原制备细胞涂片，同时设HP-PRRSV M蛋白MAb 3F7为阳性对照，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，以山羊抗小鼠IgG-FITC(1:120)作为二抗，通过间接免疫荧光试验(IFA)筛选阳性杂交瘤细胞。将PRRSV各结构蛋白质粒分别转染293T细胞，将收获的表达PRRSV各结构蛋白的细胞作为检测抗原，参照上述IFA方法鉴定阳性杂交瘤细胞与其反应的结构蛋白。将分泌MAb的杂交瘤细胞体外连续传10代并冻存于液氮中，每代杂交瘤细胞以及冻存6个月的阳性杂交瘤细胞均采用上述IFA检测杂交瘤细胞分泌MAb的稳定性。根据文献[5]制备小鼠腹水冻存于-70℃。制备的MAb按照试剂盒说明鉴定其亚类。

1.3 MAb识别的抗原表位的鉴定及序列分析 已报道的PRRSV GP4蛋白最长的表位含有11个氨基酸[6]，将包含最长表位的GP4分成部分重叠的GP4-1、GP4-2和GP4-3 3个片段(表1)，各片段均经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后克隆于pGEX-6p-1载体中。含有pGEX-GP4-1/2/3的重组菌Rosetta(DE3)经IPTG诱导后裂解，以MAb腹水(1∶10 000)为一抗，DyLight 800TM标记羊抗鼠 IgG(1∶10 000)为二抗，western blot鉴定MAb识别的片段，将识别的阳性片段再逐步截短表达，直到筛选到最小的抗原表位。

参照GenBank中28株国内外PRRSV分离株GP4的氨基酸序列，利用DNAStar比对分析本研究制备的MAb识别的抗原表位在不同参考株间的差异。将与PRRSV SD53株GP4氨基酸序列中的该抗原表位存在差异的部分PRRSV株接种Marc-145细胞，按照上述IFA检测与该MAb反应的PRRSV，并分析MAb识别的表位的保守性。

1.4 MAb中和活性的检测 采用固定病毒稀释抗体法，将杂交瘤细胞注射5只小鼠后分别制备的腹水经2倍倍比稀释。分别取200 TCID50的PRRSV SD53株、HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株病毒液与等体积不同稀释度的小鼠腹水混合，37℃水浴感作1 h。将各病毒与腹水的混合物接种96孔板培养48 h后的Marc-145细胞，每孔100 μL(含100 TCID50各病毒)。同时以接种SP2/0骨髓瘤细胞制备的腹水与病毒液混合物为阴性对照，以分别接种PRRSV SD53株、HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株病毒液为病毒对照，以未接种的细胞为细胞对照。37℃培养5 d，观察扩增CPE，采用Reed-Muench法计算腹水的中和效价。

表1 扩增PRRSV SD53不同长度GP4基因的引物

2 结果与讨论

2.1 GP4 MAb的制备与鉴定 经IFA筛选获得一株与PRRSV SD53呈阳性反应的杂交瘤细胞株，将其命名为LM26(图1)。将阳性杂交瘤细胞培养上清与转染PRRSV各结构蛋白质粒的293T细胞进行IFA检测，结果显示，获得的MAb LM26仅与GP4蛋白反应出现绿色荧光(图1)，表明，LM26是针对PRRSV GP4蛋白的MAb。将每代阳性杂交瘤细胞及将冻存6个月的阳性杂交瘤细胞经IFA检测均为阳性。表明获得了稳定分泌PRRSV GP4蛋白的MAb LM26。经抗体亚类鉴定，LM26为IgG2a亚类，轻链为κ链。

2.2 MAb识别的抗原表位鉴定与序列分析 将一系列截短的GP4重组蛋白作为抗原，进行western blot鉴定，结果显示 GP4-1(aa1～aa70)和 GP4-2(aa48～aa123)能够被 LM26识别，重叠部分为aa48～aa70；进一步将重叠部分截为3段F1、F2、F3，结果显示，LM26识别F3(aa54～aa65)片段，进而将F3从N-端、C-端逐个缺失氨基酸(P1～P7、S1～S7)，显示LM26与P1、P2、S1、S2发生特异性结合，与其余片段均不反应(图2A)，表明LM26 MAb识别的氨基酸序列为57VVLQDI62。将该序列与在GenBank中下载的28株国内外PRRSV株GP4氨基酸序列比对，结果显示GP4的aa57～aa62在HP-PRRSV株以及类NADC30 PRRSV株中高度保守；在经典PRRSV株(CH-1R、MLV)中存在2个突变位点，分别是V57A和Q60H；在欧洲PRRSV株(DV)中存在1个突变位点V57M。IFA检测结果显示，LM26与经典株CH-1R、MLV反应，推测该表位在发生V57A和Q60H突变后仍能够被LM26识别；而LM26与欧洲株DV不反应，推测V57M突变影响了LM26与表位的识别(图 2B)。由此推测V57A、Q60H突变不影响LM26对抗原表位的识别，因此该表位在美洲型PRRSV中相对保守。

2.3 MAb中和活性的检测结果 在Marc-145细胞中接种MAb LM26制备的腹水与各PRRSV病毒液混合物，观察接种后的细胞出现CPE情况，按Reed-Muench法计算其中和效价。结果显示，经5只小鼠制备的MAb LM26的腹水仅对SD53株具有中和活性，中和效价最低为1∶6，最高为1∶50；表明，不同小鼠制备的MAb，其中和效价也不相同，MAb的中和效价与小鼠个体差异有关。该腹水对HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株不具有中和活性。表明，LM26仅针对PRRSV SD53株具有中和活性。

为了保持病毒蛋白良好的免疫原性，保持其天然构象[7]，本研究采用PRRSV SD53株超离病毒为免疫原免疫小鼠，免去了体外表达蛋白的繁琐过程。本研究丰富了PRRSV的MAb库，并且为探究PRRSV GP4的抗原结构奠定了基础。