早期动脉粥样硬化患者的血清代谢组学研究*

吕晓鹏，张泽群，王春梅

（1.长春市人民医院 康复医学科，吉林 长春 130051；2.北华大学药学院， 吉林 吉林 132013)

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是脂质代谢紊乱造成的血管病变，为大多数心脑血管疾病的共同病理基础[1]。冠状动脉造影和动脉波传导速度虽然可作为有效的检测方法，但是由于价格昂贵、步骤繁琐及造成创伤等原因难以大范围应用[2]。代谢组学技术已成为众多疾病早期诊断的重要依据[3-4]。本研究运用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术的代谢组学方法寻找潜在的生物标志物，为AS早期临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、甲酸（色谱纯，美国TEDIA试剂公司），超纯水由Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）制备。

1.2 仪器与设备

VaSera VS-1000无创动脉血管弹性测定仪（日本福田公司），Waters Acquity超高效液相色谱系统（美国Waters公司），Q-TOF SYNAPT G2 HDMS质谱仪（美国Waters公司，配有ESI离子源）。

1.3 方法

1.3.1 样本收集选取2016年3月—2017年6月长春市人民医院收治的24例健康志愿者（对照组）和27例AS患者（AS组），血液样本由本院心内科和体检中心提供。以颈-股动脉脉搏传导速度＞ 9 cm/s为AS筛选指标[5]，患者均为男性，无其他疾病。

1.3.2 血清样本的前处理清晨空腹状态下采集血液样本，3 000 r/min离心10 min，提取200μl血清加入800μl甲醇，涡旋1 min，4℃、1 200 r/min离心5 min，取上清液过0.45μm滤膜，4℃保存待测。

1.3.3 色谱条件选用Water ODS色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm），柱温30℃，流动相A：甲醇；流动相B：超纯水（0.1%甲酸）；流动相梯度：0～＜5 min，5%～＜20% A；5～＜10 min，20%～＜35% A；10～＜15 min，35%～＜60% A；15～20 min，60%～100% A。流速0.5 ml/min，进样量为5μl。

1.3.4 液相条件电离源温度：260℃；干燥气（N2）流速：10 L/min；雾化器压力：30 psig；裂解电压：160 V；锥孔电压：62 V；质量扫描范围： 100～1 100 m/z。样本测定前运用调谐液对质量轴进行校正。

1.3.5 质量控制取所有待测血清样本各50μl，混合后作为质量控制样本（quality control, QC）评价分析方法的稳定性和重复性，每8个待测定样本中插入1个QC样本。在正离子和负离子模式下各选5个离子，所选离子如下：正离子模式为m/z 136.2 681、187.0 638、214.6 059、314.2 274、418.6 837；负离子模式为m/z 162.5 545、196.6 528、242.5 286、276.4 608、318.5 960。对上述10个离子的保留时间、峰面积和质荷比进行统计分析。

1.4 统计学方法

样本运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间-质谱（UPLC/Q-TOF-MS）进行检测，得到样本的色谱图，采用MarkerLynx软件对所得信息进行提取、背景扣除、峰校准、归一化及数据简化处理，将结果转化为包含化合物保留时间与质荷比信息的.csv格式文件。再导入EZinfo 2.0软件进行统计分析，并运用偏最小二乘法判别分析法（partial least squaresdiscriminant analysis, PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）获得样本分类信息并对潜在生物标志物进行筛选，根据精确分子质量和碎裂离子特征与数据库HMDB[6]、LIPID MAPS[7]及KEGG[8]进行匹配比较，通过潜在生物标志物标准品的串联谱图特征再进行比对验证以最终确认。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、体重指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）等一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），而动脉波传导速度比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见 表1。

表1 两组一般资料比较 （±s）

表1 两组一般资料比较 （±s）

组别n年龄/岁BMI/ （kg/m2）SBP/mmHgDBP/mmHgTC/（mmol/L）TG/（mmol/L）LDL/（mmol/L）HDL/（mmol/L）动脉波传导速度/（m/s）对照组2443.62±3.4224.51±2.16125.81±7.2987.59±5.275.42±0.711.61±0.262.85±0.381.26±0.338.58±1.14 AS组2744.28±2.8523.85±1.97127.24±6.0988.60±5.335.36±0.651.68±0.252.96±0.501.23±0.299.62±1.34 t值1.0251.0421.0911.0861.0571.0611.0131.1282.217 P值0.5060.4300.3340.3840.4160.4050.5230.2710.021

2.2 UPLC/Q-TOF-MS方法的血清代谢谱分析

10个选定离子的保留时间、峰面积及质荷比相对标准偏差分别为0.17%～0.28%、6.70%～9.60%及0.00%～0.07%。结果表明，本方法分析过程中仪器和试剂的稳定性和重复性良好。正离子和负离子模式下两组典型基峰强度色谱图（base peak intensity chromatograms, BPI）中可看出两组间部分峰有差异（见图1）。PLS-DA得分图中每一个标记代表一个样本，样本在空间中位置由其化合物的种类和含量所决定，因此特征相似的样本会距离比较近，在正离子和负离子模式下，两组样本分离明显，表明两组血清代谢轮廓发生改变（见图2）。运用PLS-DA和OPLSDA法对两组样本进行分析（评价指标包括R2X和R2Y值表示模型拟合情况），Q2值表示模型的预测能力。结果表明，模型的稳定性和预测率较高。见 图1、2。

图1 两组患者典型样本BPI色谱图

图2 两组样本PLS-DA得分图

2.3 差异代谢产物鉴定和变化趋势

PLS-DA载荷图中每一个标记代表一个化合物，距离中心越远的化合物对分组的贡献越大。将VIP＞1视为差异有统计学意义变量，最终在正离子模式下共鉴定2个代谢产物，负离子模式下共鉴定4个代谢产物。列举差异代谢产物信息，与对照组比较，AS组血清中甜菜碱（t =2.164，P =0.027）含量升高，而磷脂酰胆碱（t =2.073，P =0.038）、亚油酸（t =2.127，P =0.031）、3-羟基丁酸酯（t =2.093，P =0.034）、柠檬酸（t =2.029，P =0.042）及赖氨酸（t =2.132，P =0.030）含量降低。见表2和图3。

表2 两组血清差异代谢产物鉴定结果

图3 两组样本的OPLS-DA载荷图

3 讨论

代谢组学研究的目的主要是疾病诊断或发生发展机制的探讨。AS研究中，普遍认为脂质代谢紊乱是造成AS的重要诱因，有些报道也将极低密度脂蛋白、HDL、LDL、TC及TG等指标作为代谢产物用于AS代谢组学的研究[9-10]。为获得AS早期潜在诊断指标，本研究选择AS患者时，未将血脂异常患者纳入研究范围，旨在观察血脂未发生异常时体内代谢产物的潜在变化；同时为防止性别、年龄、体重及血压等因素对实验结果的影响，对病例选择进行严格 筛选。

氨基酸代谢方面，甜菜碱作为甲硫氨酸循环过程中甲基的供体参与氨基酸代谢。大量研究表明，甜菜碱与AS发生呈正相关，是预测高脂血症和冠状动脉粥样硬化性心脏病的早期生物标志物[11]。赖氨酸在血浆白蛋白和含有apoB100的分子中以糖基化产物或氧化修饰形式存在，血中低水平游离赖氨酸在血脂发生变化时代表氧化应激的发生[12]。本研究表明，AS发生早期，血中氨基酸类物质已经产生变化，且预示氧化应激的发生。

柠檬酸作为三羧酸循环的重要中间体，其参与体内脂肪、蛋白质及糖类物质的代谢过程，也是体内能量供应的中间环节。有研究表明柠檬酸和其他参与三羧酸循环的物质与AS密切相关[13]，表明AS发生早期体内三羧酸循环出现紊乱。亚油酸作为一种多不饱和脂肪酸，是花生四烯酸转化为前列腺素途径的前体物质。有研究表明，花生四烯酸及其代谢产物前列腺素和白三烯在AS和高血压发生过程中密切相关。也有研究报道，亚油酸在降低血清TC和LDL水平方面起重要作用[14]。3-羟基丁酸酯是由乙酰辅酶A生成的一种酮体。以往研究认为，3-羟基丁酸酯的减少意味着高脂血症的发生、发展过程中酮体的积累及乙酰乙酸向丙酮转化的降低，表明脂肪酸氧化作用的增强[15]。磷脂酰胆碱是HDL中最为主要的脂质，可通过清除过多TC及改善血中胆固醇和脂质的溶解度来影响脂质和胆固醇的沉积；同时磷脂酰胆碱也是合成极低密度脂蛋白的重要物质，如果不足则会造成肝脏脂肪的堆积[16]。

综上所述，运用基于UPLC/Q-TOF-MS技术的代谢组学方法对AS男性患者血清代谢谱进行研究，共鉴定甜菜碱、磷脂酰胆碱、亚油酸、3-羟基丁酸酯、柠檬酸及赖氨酸6个差异代谢产物。表明在AS发生早期体内氨基酸代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢及三羧酸循环发生了变化，这些变化有助于了解AS的发生、发展过程，为AS早期筛查提供新的参考依据。