人参茎叶总皂苷对肾上腺素致家兔肺水肿的保护机制研究*

李福智，侯阳

（1.锦州医科大学附属第三医院 胸外科，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学 生命科学研究院，辽宁 锦州 121001）

近年来国内学者确认了人参具有改善糖尿病、保护心肌组织等作用[1-2]。有实验证实人参茎叶总皂苷能改善小鼠实验性肺纤维化，对博来霉素所致的小鼠肺纤维化具有保护作用，其作用机制可能与其抑制氧化损伤有关[3]。本课题探讨人参茎叶总皂苷对肾上腺素（Adrenaline, AD）致家兔肺水肿的作用及 机制。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

普通级家兔，体重2～3 kg，雌雄各半，由锦州医科大学提供[SCXK（辽）2017-0002]。人参茎叶总皂苷（纯度82%，辽宁新宾制药有限公司），AD（上海禾丰制药有限公司），氨基甲酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，C/EBPα、mTOR及S6K1抗体均购自上海生工生物工程股份有限公司，SirT1、NLRP3抗体购自沈阳万类生物科技有限公司，兔二步法检测试剂盒、二氨基联苯胺均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BL-420生物机能实验系统、张力换能器购自成都泰盟软件有限公司，石蜡切片机（德国莱卡公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 药物干预及取材

将18只家兔随机分成对照组、模型组和治疗组，每组6只。家兔称重后，常规麻醉（质量分数25%氨基甲酸乙酯4 ml/kg耳缘静脉注射）、固定，行气管插管，并与BL-420生物信号采集系统连接，记录呼吸变化。对照组：灌胃等体积生理盐水。模型组：灌胃等体积生理盐水，30 min后耳缘静脉注射AD 1 mg/只，复制AD肺水肿模型，观察30 min。治疗组：以50 mg/kg灌胃人参茎叶总皂苷，连续7 d，末次给药30 min后耳缘静脉注射AD 1 mg/只，并观察30 min。观察完毕，处死家兔，取肺脏观察并称量其湿重，计算肺系数=肺湿重（g）/体重（kg）×100%。取肺组织，按照试剂盒说明书检测SOD、MDA。

1.3 病理学观察

常规石蜡切片和苏木精-伊红染色。参照王宝娟 等[4]的方法对肺组织进行病理损伤评分。采用免疫组织化学SP检测C/EBPα蛋白在石蜡包埋标本的表达情况。按试剂盒说明书进行操作，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗作为阴性 对照。

1.4 流式细胞术

取肺组织，用眼科剪将组织剪碎、匀浆，使用移液枪反复吹散，直至无明显的组织块，经100目筛网过滤后，1 500 r/min离心3 min，除去上清，连续3次后弃上清。按1∶100稀释mTOR和S6K1一抗，每管加入75μl，室温孵育30～60 min。加入500μl PBS洗涤2次，所有管内加入l∶100稀释的75μl Cy3标记的荧光二抗，室温孵育20～30 min。加入500μl PBS洗涤2次待测。流式细胞仪激光管预热30 min，用荧光微球调整仪器。以对照管为空白定标，计算1×104个细胞，采用流式细胞仪配套软件进行数据读取和分析，记录标本mTOR和S6K1蛋白的 表达。

1.5 Western blotting

取肺组织放入液氮研磨，加入500μl裂解液与磷酸酶抑制剂混合液（100∶1）充分裂解。用聚氰基丙烯酸正丁酯试剂盒检测样品蛋白浓度。转膜后 Western blotting封闭液封闭30 min。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育2 h，曝光显影检测蛋白质。依据刘梅梅等[5]的方法计算条带与β-actin的平均光密度比值

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺系数、MDA和SOD含量比较

各组肺系数、MDA和SOD含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；进一步两两比较，模型组肺系数、MDA较对照组升高（P ＜0.05），SOD较对照组降低（P ＜0.05）；治疗组肺系数、MDA较模型组降低（P ＜0.05），SOD较模型组升高（P ＜0.05）。见表1。

2.2 各组静脉注射AD后呼吸频率比较

各组静脉注射AD后呼吸频率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的呼吸频率比较，差异有统计学意义（F =423.976，P =0.000）；②各组呼吸频率比较，差异有统计学意义（F =1229.138，P =0.000），模型组家兔静脉注射AD后10、20及30 min的呼吸频率高于对照组和治疗组，呼吸急促表浅；③各组呼吸频率变化趋势比较，差异有统计学意义（F =213.900，P =0.000）。见表2和 图1。

表1 各组肺系数、MDA和SOD含量比较 （n =6，±s）

表1 各组肺系数、MDA和SOD含量比较 （n =6，±s）

组别肺系数MDA/（nmol/mg）SOD/（u/ml）对照组4.9±0.90.9±0.18.6±1.3模型组11.5±1.43.1±0.34.5±0.6治疗组8.8±1.21.5±0.17.8±1.1 F值7.26635.2194.166 P值0.0060.0000.036

表2 各组静脉注射AD后不同时间呼吸频率比较 （n =6，次/min，±s）

表2 各组静脉注射AD后不同时间呼吸频率比较 （n =6，次/min，±s）

组别10 min20 min30 min对照组40.0±4.739.2±4.339.7±5.1模型组99.6±5.5133.9±6.2159.3±6.1治疗组82.0±3.3119.0±4.2112.6±4.9

2.3 人参茎叶总皂苷对各组AD所致肺水肿病理学变化的影响

对照组肺组织肺泡无萎陷，无毛细血管扩张、充血及白细胞附壁，肺泡和肺间质无炎症细胞浸润，肺泡壁无增厚现象；模型组见肺泡壁断裂，肺泡隔明显增宽，有尘细胞。治疗组肺组织上述改变明显减轻。C/EBPα在细胞质和细胞核中均表达，阳性染色呈现粗大棕黄色颗粒。对照组阳性细胞少。模型组与对照组比较，阳性细胞表达增加。治疗组较模型组阳性细胞表达减少。见图2、3。

图1 各组静脉注射AD 30 min后呼吸曲线变化

2.4 各组肺组织损伤评分比较

对照组、模型组和治疗组肺组织损伤评分分别为（0.7±0.1）、（4.3±0.9）和（2.6±0.6）分，经方差分析，差异有统计学意义（F =5.123，P =0.020）；模型组较对照组升高（P ＜0.05），治疗组较模型组降低（P ＜0.05）。

2.5 各组mTOR和S6K1蛋白表达率比较

对照组、模型组和治疗组mTOR蛋白表达 率分别为（3.05±0.98）%、（8.02±0.98）%和（4.36± 1.00）%，对照组、模型组和治疗组S6K1蛋白表达率分别为（3.03±0.96）%、（12.44±1.08）%和（5.05±0.99）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =6.904和25.708，P =0.007和0.000），模型组较对照组升高（P ＜0.05），治疗组较模型组降低（P ＜0.05）。见 图4。

图2 肺组织切片光镜图 （HE×100）

图3 肺组织CCAAT增强子结合蛋白α的切片光镜图 （×200）

图4 各组mTOR和S6K1蛋白的表达

2.6 各组NLRP3和SirT1蛋白相对表达量比较

对照组、模型组和治疗组NLRP3蛋白相对表达量分别为（0.41±1.01）、（0.83±1.09）和（0.70±0.98），SirT1蛋白相对表达量分别为（0.51±0.05）、（0.32± 0.02）和（0.55±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F =4.810和6.768，P =0.024和0.008），模型组NLRP3蛋白相对表达量较对照组升高（P ＜0.05），SirT1蛋白相对表达量较对照组降低（P ＜0.05），治疗组NLRP3蛋白相对表达量较模型组降低（P ＜0.05），SirT1蛋白相对表达量较模型组升高（P ＜0.05）。见图5。

图5 各组NLRP3和SirT1蛋白的表达

3 讨论

本实验复制AD致急性肺水肿家兔模型，从肺系数变化、呼吸变化和组织学来探讨人参茎叶总皂苷对肺水肿的作用。本研究结果显示，治疗组的肺系数较模型组减小，家兔在静脉注射AD后10、20及30 min呼吸频率低于模型组，在组织学方面也有改善作用，表明人参茎叶总皂苷对家兔AD型肺水肿有一定治疗效果。同时，本研究也考察了人参茎叶总皂苷对肺脏抗氧化的作用。人参茎叶总皂苷对AD所致的肺水肿具有保护作用，其作用机制可能与其抑制氧化损伤有关。与文献[6-7]显示人参茎叶总皂苷抗氧化作用一致。

C/EBPα是CCAAT增强子结合蛋白家族的重要成员，C/EBPα对肺上皮细胞的发育和分化有重要作用[8]。关于C/EBPα与肺相关疾病的研究更多是关于肺癌方面，最近研究显示C/EBPα抑制肺腺癌细胞侵袭和迁移[9]。本研究显示模型组C/EBPα表达增多，而治疗组则显示C/EBPα减少，因此笔者推测人参茎叶总皂苷是通过抑制C/EBPα的表达，而降低急性肺损伤。

mTOR可以协调许多合成代谢和分解过程，也是调节细胞的增殖与分化及蛋白质合成关键信号中 枢[10]。有报道显示，肺上皮中mTOR的活化促进脂多糖诱导的急性肺损伤[11]。人参皂苷Rh2通过调节小鼠TLR4/PI3K/AKT/mTOR、Raf-1/MEK/Erk和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，改善脂多糖诱导的急性肺损伤[12]。mTOR/p70S6K信号通路与很多损伤研究有关。在体外氧化应激模型中，柚皮素能降低细胞内氧自由基的积累，提高细胞的存活率。其机制可能与激活mTOR/p70S6K信号通路、改善胰岛素有关[13]。急性肺损伤病程中mTOR信号通路活化，应用雷帕霉素可有效抑制mTOR信号通路过度活化，并能部分缓解肺组织病理损伤程度[14]。本研究提示人参茎叶总皂苷对AD所致家兔肺损伤有保护作用，其机制可能与抑制mTOR/S6K1蛋白表达有关。

有学者报道NLRP3炎性蛋白肺损伤和肺组织炎症有关[15-16]。SIRT1抑制NLRP3炎症小体[17]。另外，人参皂苷对NLRP3炎性体激活有抑制作用[18]。结合文献[16-18]与本研究结果提示，人参茎叶总皂苷对AD所致家兔肺损伤有保护作用，其机制可能与SIRT1/NLRP3蛋白表达有关。

综上所述，本研究通过动物模型实验探讨人参茎叶总皂苷对急性肺损伤的作用及C/EBPα、mTOR信号通路机制。结果显示，人参茎叶总皂苷对AD急性肺损伤异常病理状态有改善作用，改善肺组织氧化指标和凋亡，可能与C/EBPα、mTOR信号及SIRT1/NLRP3通路有关。