吉西他滨对人舌鳞癌Tca8113细胞的放射增敏作用及其机制研究*

刘星验，张斌，马竟，陈健

（1.锦州医科大学附属第一医院 口腔颌面外科，辽宁 锦州 121000；2.葫芦岛市第二 人民医院，辽宁 葫芦岛 125000）

舌癌是最常见的口腔癌[1]，有较强的局部浸润性和转移率高等特点，可导致咀嚼、言语和吞咽等功能失常，甚至有死亡的风险。舌癌对放射的敏感性不高，临床上主要是手术治疗，积极探讨放疗增敏的新方法成为研究热点之一[2]。吉西他滨（Gemcitabine, GEM）是脱氧胞苷的水溶性类似物[3]，具有放射增敏作用强，毒副作用较小的特点[4]。本研究以GEM联合放疗作用于舌鳞癌Tca8113细胞，研究其对Tca8113细胞放射敏感性的影响及可能的作用机制，为舌癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞舌鳞癌Tca8113细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所。

1.1.2 试剂GEM购于美国ApexBio公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国HyClone公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）购于北京索莱宝科技有限公司，链霉素/青霉素（双抗）、四甲基偶氮唑蓝（ttihiazoly blue, MTT）购于上海碧云天生物技术有限公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，流式细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养Tca8113细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，置于37.0℃、5%二氧化碳CO2恒温细胞培养箱中，定期传代、换液，取对数期Tca8113细胞进行实验。

1.2.2 MTT法测定取对数生长期的Tca8113细胞，消化、重悬、计数后置于96孔板内，5×103个/孔细胞，每组设3个复孔，测量重复3次。细胞贴壁后，加入不同浓度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）完全培养基培养24 h后终止培养，每孔加入质量浓度为5 mg/ml的MTT 20μl，37℃条件下孵育4 h。弃上清液，每孔加入150μl DMSO。摇床上震荡10 min，使用多功能酶标仪在490 nm波长处测定光密度（optical density, OD）值。以OD值显示实验结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。据此计算出GEM对Tca8113细胞增殖的影响，选定最佳浓度进行后续 实验。

取Tca8113细胞接种于96孔板内，每孔细胞数为5×103个，将其分为空白对照组、GEM组（0.02μmol/L）、单纯放疗组（4 Gy）、GEM（0.02μmol/L）联合放疗组（4 Gy）。处理24 h，用MTT法明确最佳照射剂量。

1.2.3 平板克隆实验将1×103个Tca8113细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁后弃培养液分为空白对照组、GEM组、单纯放疗组、GEM联合放疗组。加入GEM处理细胞24 h，暴露于4 Gy照射，继续在孵箱中孵育10～14 d，弃培养液，洗涤、固定及染色后，计数各孔集落数（≥50个细胞为1个集落）。计算各组细胞克隆率。

1.2.4 流式细胞术将Tca8113细胞用0.02μmol/L GEM处理24 h后，4 Gy照射或不予处理，与空白对照组比较。5 min离心1 500 r/min收集悬浮细胞。贴壁细胞用胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2次，并进行细胞计数、离心，收集1×105～3×105个细胞，将收集的细胞重悬于150μl染色溶液中，加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入10μl Propidium Iodide混匀，室温避光反应5～15 min。应用流式细胞仪测量细胞凋亡率。

1.2.5 Western blotting0.02μmol/L GEM处理Tca8113细胞24 h后，吸出培养液，放疗继续作用细胞24 h，Western blotting检测各组Tca8113细胞中Bax、Bcl-2、 Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平。收集空白对照组、GEM组、单纯放疗组和GEM联合放疗组的细胞，胰酶消化后将收集的细胞离心并重悬于裂解缓冲液中。冰上孵育30 min后，提取澄清匀浆4℃、12 000 r/min离心20 min。BCA蛋白定量试剂盒检测各组蛋白浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，300 mA湿转90 min，室温下使用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应稀释比例的一抗孵育过夜，洗膜后室温下孵育二抗1 h，化学发光法显影、定影后扫描分析。采用Image J图像分析软件分析灰度值，计算出样本蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT测定结果

2.1.1 GEM对Tca8113细胞活力的抑制作用不同浓度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）作用时细胞存活率分别为（100.00±0.00）%、（98.59±0.20）%、（95.46±0.08）%、（94.79±0.08）%、（93.95±0.24）%、（91.77±0.54）%及（73.90±2.98）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =171.025，P =0.000）；与0.000μmol/L组比较，GEM浓度为0.010、0.020、0.030、0.100、1.000μmol/L时细胞存活率降低（P ＜0.05）。见图1。

图1 Tca8113细胞在不同浓度时的细胞存活率曲线

2.1.2 GEM对放疗的增敏作用空白对照组、GEM组、单纯放疗组和GEM联合放疗组细胞存活率分别为（100.00±0.00）%、（84.83±1.78）%、（80.64±1.44）%和（73.95±1.24）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =214.368，P =0.000）；与空白对照组比较，其他各组细胞存活率降低（P ＜0.05）；与单纯放疗组比较，GEM联合放疗组细胞存活率降低（P ＜0.05）。见 图2。

图2 各组Tca8113细胞存活率比较 （±s）

2.2 GEM联合放疗对Tca8113细胞集落形成的影响

放射剂量选定4 Gy，空白对照组、GEM组、单纯放疗组和GEM联合放疗组克隆形成率分别为（33.83±1.15）%、（28.46±1.42）%、（15.50±1.10）%和（0.00±.00）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =593.548，P =0.000）；与单纯放疗组比较，GEM联合放疗组克隆形成率降低（P ＜0.05），几乎处于静止期。见图3。

2.3 GEM增强射线诱导细胞的凋亡

流式细胞术检测发现，空白对照组、GEM组、单纯放疗组和GEM联合放疗组细胞凋亡率分别为（0.03±0.01）%、（5.68±0.18）%、（6.54±0.23）%和（28.63±0.38）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =7959.927，P =0.000）。与空白对照组比较，GEM组和单纯放疗组的Tca8113细胞发生凋亡（P ＜0.05）；两者联用后较单纯放疗组凋亡率升高（P ＜0.05），说明GEM能增强放疗对Tca8113细胞的敏感性。见图4。

2.4 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平

图3 各组Tca8113细胞克隆实验细胞集落形成图

图4 GEM联合放疗对Tca8113细胞凋亡的影响

各组细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与空白对照组比较，GEM组、单纯放疗组和GEM联合放疗组中Bcl-2蛋白相对表达量降低（P ＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相对表达量升高（P ＜0.05）；GEM联合放疗组中Bcl-2蛋白相对表达量较单纯放疗组和GEM组降低（P ＜0.05）；GEM联合放疗组中Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相对表达量较单纯放疗组和GEM组升高（P ＜0.05）。线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表达增强或减弱可能是GEM提高放疗诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡作用的机制之一。见表1和图5。

表1 各组细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平比较 （±s）

表1 各组细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平比较 （±s）

组别Bcl-2BaxCleaved Caspase-3Cleaved Caspase-9空白对照组0.949±0.0020.347±0.0370.597±0.0150.040±0.007 GEM组0.904±0.0000.591±0.0111.113±0.0740.125±0.005单纯放疗组0.883±0.0030.802±0.0071.519±0.0300.147±0.006 GEM联合放疗组0.787±0.0040.892±0.0042.060±0.0530.523±0.014 F值1 549.012437.764479.0141 651.308 P值0.0000.0000.0000.000

图5 Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表达的变化

3 讨论

舌癌是恶性程度极高的口腔癌，放疗是提高生存率的重要治疗手段之一。既往研究发现，GEM能提高乏氧细胞对放射线的敏感性，抑制DNA合成，从而达到抗肿瘤作用[5]。本实验旨在研究GEM联合放疗时，提高对Tca8113细胞增殖的抑制、凋亡的能力，从而起到放疗增敏作用的机制。

有研究表明，GEM对胰腺癌细胞的增殖有抑制作用，且呈浓度依赖性[6]。本实验得出相类似的结果，在此基础上将放疗与GEM联合作用于Tca8113细胞，发现GEM联合放疗组比单纯放疗组细胞存活率低。克隆形成实验和流式细胞术的结果说明，GEM对Tca8113细胞具有放射增敏作用。

线粒体介导的内源性途径为细胞凋亡早期的重要途径[7-8]。本实验选取线粒体途径相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9作为监测指标，进一步探究GEM增强Tca8113细胞的放射敏感性。在线粒体介导的凋亡途径中[9]，Bax为线粒体上的一种跨膜因子，在凋亡信号的诱导下，Bax转移到线粒体外膜处，促进线粒体膜通透性的改变，释放的细胞色素C能与Caspase-9形成凋亡小体，Caspase-9自我活化后再激活Caspase-3，从而促进细胞凋亡。LI等[10]发现，GEM作用于人胰腺癌CFPAC-1细胞系后，抑制Bcl-2蛋白的表达，即Bax/Bcl-2比率升高，两者形成同二聚体，降低线粒体跨膜电位。随着Ca2+浓度升高，激活启动因子Caspase-9，进一步诱导“死亡蛋白酶”、Caspase-3，进而引起细胞走向凋亡。研究表明，经GEM联合放疗处理的胰腺癌BXPC-3细胞出现Bax基因表达升高，Bcl-2基因表达降低，这些细胞表现出更高的放射敏感性[11]。本实验研究GEM联合放疗作用于舌鳞癌Tca8113细胞得出类似结果，与单纯放疗组比较，GEM联合放疗组可通过诱导舌癌Tca8113细胞中Bcl-2蛋白，使Bcl-2蛋白表达水平下降，Bax蛋白表达则升高。Caspase-3是Caspase级联反应中发挥凋亡作用的执行者，Caspase-3通常以酶原的形式存在，活化后形成C1eaved Caspase-3发挥凋亡作用[12]。本实验中，GEM联合放疗组中C1eaved Caspase-9、C1eaved Caspase-3蛋白表达比单纯放疗组更显著，与Bcl-2表达变化相反。笔者推测，GEM联合放疗可以通过线粒体介导内源性途径诱导Tca8113细胞的凋亡，增加放射敏感性，这与WOUTERS等[13]研究结果一致。

综上所述，GEM具有增强放疗诱导Tca8113细胞凋亡的能力，可提高舌癌的放射敏感性。其主要机制可能是促进Bax基因的表达，抑制Bcl-2进而激活Caspase-9，活化Caspase-3，下游底物剪切被激活，进而诱导细胞凋亡。