秦巴硒菇提取物对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖与凋亡的调节作用的实验研究

李 娟，袁作辉，杨 帆，王倩凤

（甘肃省人民医院干部病房，甘肃 兰州 730000）

肝癌是起源于肝脏的上皮或间叶组织的恶性肿瘤[1]，近年来肝癌的发病率在全球范围内均有增加的趋势[2]，据2018年全球癌症数据统计，2018年全球癌症死亡率最高的五大癌症中就包括肝癌[3-4]，肝癌新增人数达841 080例，占比4.7%，肝癌死亡人数781 631，占比8.2%，肝癌在我国尤为高发，是造成我国癌症死亡的第四大原因[5-7]，肝癌死亡率是仅次于胃癌和食管癌的第三大消化系统恶性肿瘤[8-9]，并且其发病率呈逐年上升的趋势。肝癌的早期发病隐匿，病程进展至中后期会迅速侵袭转移，恶性程度较高，目前临床上进行手术切除和肝移植以及术后联合放化疗是治疗的主要手段[10-12]，但仅有30%的肝癌患者适合手术治疗，但因超过80%的患者就诊时已是晚期，常常错过最佳的手术治疗时机，即使经过治疗也不能较好地改善患者生活质量，并且术后复发率高，5年生存率仅有15%，预后差[13-14]，严重威胁着人类的身体健康。因此，寻找新的肝癌治疗药物是延长肝癌患者生存时间、降低肝癌死亡率的关键。探寻以抑制肝脏肿瘤细胞增殖、诱导凋亡为切入点，探究一种新型、安全且有效的抗肿瘤药物成为目前肝癌治疗的新思路，也是提高临床疗效及辅助外科治疗的新方法[15-18]。我国有丰富的中药来源，一些植物提取物成为抗肿瘤药物的重要来源，例如苦参碱、紫杉醇、秦巴硒菇提取物等。因此，近年来天然产物的抗癌活性受到广泛关注[19]。其中，中药秦巴硒菇（AgaricusblazeiMurrill-Qbsg）中富含β-葡聚糖，对自身免疫系统有着很强的刺激作用。在试管培养及动物模型中，秦巴硒菇中的β-葡聚糖都显示出了抗肿瘤作用。从秦巴硒菇多糖中提取的酸性RNA蛋白复合物（FA-2-bβ）具有较强的抗肿瘤活性，具有抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖的活性，FA-2-b-β有抗感染、调节机体免疫功能、抗过敏、修复肝损伤、促进肿瘤细胞凋亡的效果[20-21]。因此，本研究利用体外培养肝癌细胞SMMC-7721，并给予不同浓度的秦巴硒菇提取物处理，探究秦巴硒菇提取物对肝癌细胞增殖、凋亡能力的影响，并进一步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、药物及试剂 人肝癌SMMC-7721细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，秦巴硒菇、胰蛋白酶、甲基噻唑蓝（MTT）、胎牛血清DMEM完全培养基购于美国Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司，反转录试剂盒及RT-qPCR试剂盒购于TAKARA公司，抗 P53、Caspase3、Caspase9、内参一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、β-actin购自上海英骏生物技术有限公司，二抗购于北京索莱宝有限公司。

1.1.2 主要仪器 多功能酶标仪（美国Thermo公司）、CO2培养箱（中国力康生物公司）、超净工作台（Thermo Forma）、倒置显微镜（OlympusBX51）、流式细胞仪（德国ParcGmbh，CyFlow Space公司）、低温离心机HITACH（日本CF-16RX公司）、自动细胞计数仪（Invitrogen Countess）、BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机（美国Thermo scientific公司）、全波长分光光度计（上海UNICO公司）、Trizol及RIPA裂解液（美国MRCMolecular Research Center公司）、自动蒸汽消毒锅（日本SANYO公司）、-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司）、凝胶成像仪、垂直电泳槽、湿式转膜槽 (美国BIO-RAD公司)、3 mmWhatman滤纸（美国GE公司）

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃含5%CO2的饱和湿度培养箱内培养，每日观察细胞生长情况，每隔1～2天换液一次，弃去镜下观察细胞生长情况欠佳及有污染的细胞株，剩余为实验用。待细胞生长达80%左右时对细胞进行不同浓度秦巴硒菇提取物处理并进行后续实验。

1.2.2 细胞增殖抑制率 取对数生长期SMMC-7721细胞，以1×105/mL细胞浓度种植96孔细胞培养板中，常规培养24 h，DMEM完全培养基稀释秦巴硒菇提取物至浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL，阴性对照组加入 100 μL DMEM 完全培养基，每组设3个复孔。秦巴硒菇提取物处理48 h后，小心吸弃上层含药物培养基。每孔加入10%MTT的完全培养基继续培养4 h，弃掉上清液，加入DMSO，振荡溶解10 min。在490 nm波长处测定吸光度值（OD值）。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组细胞OD值/阴性对照组细胞OD值）×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测 人肝癌SMMC-7721细胞种植于细胞60 mm培养皿中，待细胞增长达对数生长期后，分别加入浓度分别为 0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL 的秦巴硒菇提取物，继续培养 48h，以胰酶消化并收集细胞，用高速离心机1000 r/min离心5 min，PBS清洗两次，以Annexin V-FITC在暗室中孵育30 min，然后加入2 μL的PI（100 μg/mL），用流式细胞分析检测SMMC-7721细胞凋亡情况。

1.2.4 实时定量PCR 取对数生长期细胞以2.5×105/mL的浓度种植于60 mm培养皿中，培养24 h后分别加入不同浓度秦巴硒菇提取物，使终浓度为 0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL，继续培养48 h后，加入1 mL Trizol裂解细胞并收集细胞于无酶EP管中，加入0.2 mL的三氯甲烷，剧烈震摇EP管25～30次，4℃离心15 min，取上清并加入等体积的异丙醇，轻摇EP管10次，放置-20℃冰箱，离心后吸弃去上清液，加入1 mL75%无水乙醇，重悬后离心，吸弃上清，室温自行干燥，加入适量无RNA酶水，室温放置10 min。NANODROP2000中检测RNA浓度及纯度。由于RNA保存不当时宜降解，影响其浓度及纯度，遂取2 μgRNA按照TAKARA公司试剂盒反应体系说明书，立即将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，按照TAKARA公司的qPCR试剂盒反应体系加样，在实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，反应条件为：95℃30 sec；95℃5 sec；60℃30 sec共 45个循环。β-actin作为管家基因进行校准。采用2-ΔΔCt相对定量法分析结果，ΔΔCt=实验组（Ct目的基因-Ct管家基因）-对照组（Ct目的基因-Ct管家基因），相对表达=2-ΔΔCt。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达 不同浓度秦巴硒菇提取物作用于细胞后，收集细胞，用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度并调平。取等量的蛋白质用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶进行分离，蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭室温摇床上1 h，TBST稀释一抗4℃孵育过夜（一抗的稀释比例下：P53：1∶1 200；Caspase3：1∶1 000；Caspase9：1∶1 000；β-actin：1∶2 000），复温 1 h，TBST 洗膜 3 次，加入 TBST 稀释的二抗（二抗稀释比例1∶1 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次。将PVDF膜浸在ECL超敏发光液中1 min，在ECL发光仪上进行曝光成像。凝胶成像系统获取蛋白质条带图片，ImageJ对蛋白质条带灰度值进行定量分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 秦巴硒菇提取物对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖有明显的抑制作用，且随秦巴硒菇提取物的浓度和时间的作用增加而呈现出抑制作用更加明显，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表 1。

表1 秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞不同浓度和时间的增殖抑制率

2.2 秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

不同浓度的秦巴硒菇提取物作用于人肝癌SMMC-7721细胞24 h后，采用流式细胞分析检测细胞凋亡率的变化，结果显示不同浓度的秦巴硒菇提取物 （0.5，1，2，4 μg/mL） 作用于SMMC-7721细胞后，凋亡率明显高于对照组（0 μg/mL），且随秦巴硒菇提取物浓度增加细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表 2。

表2 秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

2.3 Annexin V/PI凋亡检测结果

应用Annexin V/PI、FCM法对秦巴硒菇提取物作用于SMMC-7721细胞作用后的凋亡现象分别进行两次定性定量的测定。流式细胞散点图分为4个象限，象限左下角LL代表正常细胞簇群，象限左上角UL代表机械损伤或坏死细胞簇群，象限右下角LR代表早期凋亡细胞簇群，象限右上角UR代表晚期凋亡或死亡细胞簇群。两次对照组细胞与其他组细胞均存在显著性差异（P＜0.05）。见图 1～2。

图1 秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用（第一组）

图2 秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用（第二组）

2.4 秦巴硒菇提取物对P53/Caspase信号通路的影响

从条带可以看出，各组的条带深浅基本一致，说明各组的细胞总量相同。本实验结果提示不同浓度的秦巴硒菇提取物均能诱导SMMC-7721细胞发生凋亡。与对照组相比，以β-actin为内参蛋白。Western Blot实验结果显示，秦巴硒菇提取物诱导了P53、Caspase-3及Caspase-9蛋白的表达，最终诱导细胞凋亡。递增浓度的秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞P53、Caspase3及Caspase9蛋白的影响，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3，表明秦巴硒菇提取物可诱导肝癌细胞P53/Caspase信号通路的激活。

图3 递增浓度的秦巴硒菇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞P53、Caspase3及Caspase9蛋白的影响

3 讨论

3.1 秦巴硒菇提取物具有抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡的作用

细胞增殖不受控制是癌症发生的主要机制之一。诱导癌细胞凋亡是大多数抗癌药物抑制癌症发展的作用机制。近年来大量研究发现，多类天然产物提取物也能通过诱导癌细胞凋亡发挥抗癌作用[22]。秦巴硒菇提取物为天然产物提取物，可抑制多种癌症细胞的增殖，诱导癌症细胞发生细胞周期阻滞，抑制细胞增殖相关通路激活，从而减缓肿瘤的生长，发挥抗癌作用[23]。本文研究也发现，高浓度的秦巴硒菇提取物能降低肝癌SMMC-7721细胞的活性。在无明显细胞毒性的剂量下，秦巴硒菇提取物作用于肝癌细胞的时间长短与浓度大小与肝癌细胞增殖倍数呈负相关，显著升高肝癌细胞的凋亡率，表现为剂量依赖性与时间依赖性，进一步提示秦巴硒菇提取物具有抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡的作用[24-25]。

3.2 秦巴硒菇提取物可诱导P53/Caspase信号通路的激活

细胞凋亡是指细胞发生程序性死亡，由多条信号通路共同调控，这些信号通路主要通过改变线粒体通透性，诱导线粒体释放凋亡诱导因子而启动细胞凋亡过程[26-27]。Caspase家族是细胞凋亡的最终执行者，Caspase家族蛋白的激活可诱导DNA降解、介导DNA损伤，最终导致细胞凋亡[28]。Caspase3是凋亡的执行分子，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。它是由CASP3基因编码的，外部死亡受体途径和内在线粒体途径启动后共同的效应酶，在凋亡肝癌细胞中明显表达[29]。而Caspase9由CASP9基因编码的凋亡启动蛋白酶，通过磷酸化进行调控激活，引发线粒体内部活化凋亡途径。诱导细胞凋亡是癌症治疗中细胞死亡的首选模式，是癌症治疗关键。P53是Caspase家族蛋白的上游调控因子，在氧化应激、紫外照射等多种应激条件诱导DNA损伤过程中均呈高表达状态[30]。P53作用于线粒体可诱导细胞色素C表达，细胞色素C可直接诱导Caspase9活化，活化的Caspase9可进一步促进Caspase3激活，从而导致细胞凋亡[31-32]。P53介导的P53/Caspase细胞凋亡信号通路是多类化疗药物治疗癌症的重要机制之一[33]。既往有研究表明，黑种草种子提取物可通过激活P53/Caspase信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡，紫草素可通过诱导P53表达升高Caspase-9表达水平，从而诱导细胞凋亡。本研究采用Western blot法检测了秦巴硒菇提取物处理肝癌细胞后，细胞P53、Caspase3和Caspase9的蛋白表达水平。结果显示，秦巴硒菇提取物在诱导P53表达的同时也能升高肝癌细胞Caspase3和Caspase9的表达水平，提示其能够诱导P53/Caspase信号通路的激活，可能是秦巴硒菇提取物诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用机制之一。

综上所述，秦巴硒菇提取物可抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡，并能促进凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表达，其作用机制可能与诱导P53/Caspase信号通路的激活有关。本研究仅初步探讨了秦巴硒菇提取物抗肝癌的作用机制，之后将通过体内实验验证并进一步探究其具体的分子作用机制，为临床开发新的肝癌治疗药物奠定实验基础。