推拿手法对家兔骨骼肌失神经支配后雪旺氏细胞S-100蛋白表达的影响

郭汝宝

周围神经损伤是指周围神经神经干或分支受到损害后，引起躯体感觉障碍、运动功能减退等症状的一类病症，临床常见、多发[1]。对于周围神经损伤的治疗是目前临床上的难点，虽然近些年神经损伤的修复水平已经有了明显的提高，但仍然不尽如人意[2]。本研究拟通过推拿手法作用于骨骼肌失神经支配的家兔，观察损伤神经的超微结构变化以及雪旺氏细胞S-100蛋白的表达水平，研究推拿手法对促进神经修复以及失神经支配后骨骼肌再生的的治疗作用及可能机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级雄性健康新西兰家兔120只，6月龄，体质量（2.0±0.3）kg，许可证号：SCXK（浙）2015-0004。由浙江中医药大学动物实验中心提供，于20℃恒温环境单笼饲养，饲养期间，予家兔标准颗粒饲料（由实验动物中心提供）及自由饮水。

1.2 药 物 注射用青霉素钠（规格：80万iu/支，批号130836-2，江西东风药业股份有限公司）；注射用鼠神经生长因子（商品名：苏肽生，规格30ug/支，批号S20060023，北京舒泰神生物制药股份有限公司）。

1.3 仪器与试剂 电子天平（上海美特勒-托利多仪器有限公司）；石蜡切片机（美国Thermo公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；透射电镜（德国Leica公司）；超薄切片机（德国Leica公司）荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；图像分析系统Image-ProPlus 5.1；戊二醛；PBS缓冲液；柠檬酸三钠；4%多聚甲醛；锇酸固定液；100%丙酮；3%醋酸铀－枸橼酸铅；UW（University of Wisconsin）液。

2 实验方法

2.1 动物分组 计算机随机区组分为四大组：正常对照组、模型组、神经生长因子（NGF）治疗组、手法治疗组，各30只，为了对检测指标做一连续动态观察，依据我们前期的研究结果，各组又按照取材时间不同进一步细分为5个亚组，分别为：2周亚组、3周亚组、1个月亚组、2个月亚组、4个月亚组。每个亚组各6只家兔。

2.2 动物造模 模型组、神经生长因子（NGF）治疗组、手法治疗组家兔均行右后肢胫神经切断术，建立失神经支配模型[3]。具体操作：3%戊巴比妥钠溶液，按0.7mL/kg剂量耳缘静脉缓慢注射麻醉后，将家兔固定于动物手术台上，右后肢剃毛，暴露大腿后部及腘窝。局部消毒，于膝上股后外侧切开小口，暴露胫神经，玻璃分针钝性分离胫神经后，于胫神经上端处切断胫神经干，并将近端神经游离端向上折返缝入股二头肌内，逐层缝合切口，于切口附近注射青霉素，预防感染。左后肢不做任何处理。正常对照组家兔仅于右后肢膝上股后外侧做同样大小切口，暴露胫神经，不做切断处理，消毒缝合切口同前。

2.3 干预措施 手法治疗组推拿干预手法为按揉法，按照《中国医学百科全书·中医学》中的手法操作标准进行操作[4]。手法的轻重及频率均通过FZ－I型推拿手法测力分析仪标定，由专人经训练后，于手法组家兔术侧腓肠肌上操作。具体操作方法：用兔用固定器固定家兔，双后肢伸出，操作者一手固定其右下肢，暴露腓肠肌部位，另一手置于腓肠肌上，沿着腓肠肌走行，给予按揉手法操作。按揉法的参数：压力19.6N、频率 140次/min，每次 10min，每天 1次，于造模后第四天开始手法干预。正常组及模型组同样给予兔用固定器固定10min，但不进行推拿手法操作。神经生长因子（NGF）治疗组：注射用鼠神经生长因子30μg，2mL注射用水溶解，予家兔右后肢腓肠肌肌肉注射，每天1次，连用3周，在造模后第4天家兔右后肢腓肠肌部位注射。模型组造模成功后，不给予任何干预措施。正常对照组不给予任何干预措施。

2.4 取材时间 三大组按照取材时间的不同，分别在手法干预2周、3周、1个月、2个月、4个月后各取6只家兔行相应的指标检测。

2.5 肌湿重比检测 将家兔过度麻醉后，将双侧腓肠肌沿股骨内外髁起点至跟骨结节止点完整取下，用电子天平称量腓肠肌的肌湿重，计算术侧与健侧的比值，即为肌湿重比。

2.6 雪旺氏细胞S-100蛋白表达免疫组化法测定取家兔右后肢断端远端胫神经约1cm组织，预冷生理盐水漂洗去表面血块后，将神经标本置入UW（U－niversity of Wisconsin）液中，每20mL UW液浸泡10条神经标本，将所取组织置于4%多聚甲醛固定液内后固定24h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，连续纵切片（片厚5μm）。采用SP法常规染色。每例检测3张切片，采用采用Zeiss ImergerA1显微镜和DXM1200 FCCD图像采集系统观察并照相，光镜下阳性反应物为突出背景的棕黄色颗粒，应用图像分析系统Image-ProPlus 5.1测定其积分光密度。

2.7 神经组织超薄切片透射电镜观察 迅速暴露出术侧下肢被切断胫神经的远端部分，并于1min内完整取下，冰台上切取成三段（近段、中段、末段），每段损伤神经组织约5mm。将其中近段神经组织放入4℃预冷的3%电镜专用戊二醛固定液中，4℃冰箱中避光保存、固定2h以上，取出组织后，PBS漂洗15min×3次，1%锇酸固定液固定1.5h（通风橱内操作），PBS漂洗15min×3次，依次按50%、70%、80%、90%酒精梯度脱水，15min×1次，100%酒精脱水20min×1次，100%丙酮20min×2次，无水丙酮与包埋剂（1：1体积混合）渗透组织1h，无水丙酮与包埋剂（1：3体积混合）渗透组织3h，纯埋剂渗透组织并震荡过夜，纯包埋剂包埋。修块成型后，超薄切片机做超薄切片，厚度约为50nm。超薄切片染色用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色20min。透射电子显微镜下观察，拍片。

3 实验结果

3.1 各组家兔腓肠肌肌湿重比比较 模型组、神经生长因子（NGF）治疗组、手法治疗组家兔各时间点肌湿重比均降低。NGF治疗组在2周、3周、1个月、2个月，手法治疗组在2周、3周、1个月、2个月、4个月高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。手法治疗组在2周、3周低于NGF治疗组，4个月时则高于NGF治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.2 各组家兔雪旺氏细胞S-100蛋白表达光密度值比较 NGF治疗组、手法治疗组家兔各个时期均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。手法治疗组在1个月、2个月均高于NGF治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

3.3 各组家兔损伤神经超微结构比较 正常对照组可见髓神经纤维数量多，成熟度均匀，并且直径大，轴突上存在完整、光滑的轴膜，轴浆丰富，轴浆中神经微丝、微管排列规整，以纵行为主，髓鞘结构完整，层板质地均匀，排列紧密，明暗相间，层板间无裂隙；模型组散见新生髓鞘结构，层板不紧密，形状多变欠规整，轴浆偏少，其内细胞器较少；NGF治疗组可见新生髓鞘多，形态较规整，髓鞘较厚，低于正常髓鞘结构，层板紧密，发育程度不一致，颜色深浅不一，轴浆充足，细胞器较丰富，周围聚集的雪旺细胞细胞器丰富，细胞核清晰；手法治疗组可见新生髓鞘多，形态较规整，髓鞘较厚，低于正常髓鞘结构，层板紧密，发育程度不一致，颜色深浅不一，轴浆充足，细胞器较丰富，周围聚集的雪旺细胞细胞器丰富，细胞核清晰。见插页图1。

4讨 论

研究发现，周围神经损伤后，局部组织通过推拿手法干预，局部肌肉兴奋，肌组织代谢增强交换，有害代谢产物堆积减少，从而改善失神经后萎缩的骨骼肌组织的代谢过程，同时也促进了一系列肌源性生物活性物质的产生及骨骼肌再生分化，使肌肉纤维化进程得到控制，延缓废用性萎缩的发生[5-7]。此外，因神经髓鞘对缺血缺氧十分敏感，手法通过促进局部血供，可减少神经内正常髓鞘的变性，减轻神经瘢痕化，共同促进受损伤神经与肌肉的恢复[8]。

表1 各组家兔腓肠肌肌湿重比比较（

表1 各组家兔腓肠肌肌湿重比比较（

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与 NGF 治疗组比较，▲P＜0.05；NGF：神经生长因子

组别正常对照组模型组NGF治疗组手法治疗组家兔数6666 2周1.00±0.02 0.53±0.01*0.79±0.03*△0.72±0.05*△▲3周0.99±0.03 0.41±0.03*0.70±0.06*△0.55±0.04*△▲1个月0.99±0.02 0.40±0.03*0.58±0.04*△0.55±0.09*△2个月1.06±0.06 0.38±0.05*0.44±0.05*△0.49±0.03*△4个月1.05±0.05 0.38±0.05*0.42±0.02*0.50±0.03*△▲

表2 各组家兔腓肠肌雪旺氏细胞S-100蛋白表达光密度值比较

表2 各组家兔腓肠肌雪旺氏细胞S-100蛋白表达光密度值比较

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与 NGF 治疗组比较，▲P＜0.05；NGF：神经生长因子

组别正常对照组模型组NGF治疗组手法治疗组家兔数6666 2周3.42±0.54 10.33±1.51*29.17±3.97*△27.00±6.29*△3周3.58±0.46 20.83±3.87*35.50±4.23*△33.17±5.27*△1个月4.01±0.87 21.17±4.62*32.83±4.12*△51.00±4.56*△▲2个月3.36±0.27 30.67±3.27*47.00±5.06*△75.83±9.66*△▲4个月3.73±0.52 53.17±7.52*113.67±13.08*△116.67±3.10*△

周围神经损伤之后，作为周围神经靶器官的骨骼肌因缺失神经营养和自身废用，迅速萎缩并失去收缩功能，大体标本上最突出的表现是肌肉萎缩。肌湿重是实验中常用于观察骨骼肌萎缩情况的一项宏观指标。以往研究观察到，周围神经切断损伤后，相关骨骼肌肌湿重迅速出现下降，随在损伤时间延长而下降速度趋缓[9]。本研究结果显示，与正常组相比，模型组2周时，腓肠肌肌湿重比已有显著下降（P<0.05），表明家兔行胫神经切断术后，腓肠肌失去神经支配，萎缩明显，达到了我们研究时需要观察损伤神经修复与萎缩骨骼肌修复两个方面的需求；3周后肌湿重比下降趋势变缓，与以往研究相近。与模型组相比，手法治疗组各时间点肌湿重比值显著增加（P<0.05）。另一方面，手法治疗组4个月时则显著高于NGF治疗组（P＜0.05），这表明手法治疗的远期疗效好于NGF治疗。

周围神经损伤主要的治疗环节之一就是失神经骨骼肌萎缩的治疗和预防,这直接关系到周围神经的恢复和预后[10]。实验研究发现，雪旺氏细胞（Schwann cells）通过分泌多种神经营养因子，是周围神经系统的主要神经胶质细胞，能够有效促进神经元再生[11-12]。周围神经损伤后的修复再生很大程度上依赖于损伤远侧端残留雪旺氏细胞的活性[13]。周围神经损伤后，雪旺氏细胞大量增殖并沿基膜管形成索状的Bngner带，诱导轴突再生并扮演临时靶器官的角色[14]。雪旺氏细胞对于神经轴突具有显著的支持和保护作用，进而在周围神经受损后的修复过程中起到了至关重要的作用，它能通过大量的增生和包绕再生轴索，来完成髓鞘化后的修复工作[15]。随着失神经时间的延长，神经纤维、轴浆及其内容物、髓鞘结构基本崩解消失，残留少量髓鞘残片，但就观察到的雪旺细胞的分布密度以及细胞器丰富程度而言，手法治疗组明显好于NGF治疗组及模型组。而雪旺细胞内细胞器的丰富度部分反映了细胞的活力，因此手法干预之后，损伤神经组织中雪旺细胞的成熟度与活跃度得到了促进。

作为周围神经的标志蛋白质，S-100既可以反映周围神经损伤的雪旺细胞得增值情况，又可以反映髓鞘的形成情况[16]。本研究结果也表明，骨骼肌失神经支配后，雪旺氏细胞S-100蛋白表达上调，NGF治疗组、手法治疗组在各个时期均高于模型组，但手法治疗组在1个月、2个月均高于NGF治疗组（P＜0.05）。表明推拿手法可能有NGF样治疗作用，同时在早期优于NGF的治疗效果。

因此，推拿手法可以延长肌细胞正常形态结构存在时间，明显减少成纤维细胞和脂肪细胞增生程度，延缓失神经支配后肌肉的萎缩，促进损伤神经中雪旺细胞增殖及髓鞘新生、成熟，为周围神经损伤后肌肉受神经成功再支配保留基础，推拿手法干预对促进损伤神经的修复及延缓骨骼肌的萎缩是有效的。