聚乙二醇修饰的纳米金三角颗粒对乳腺癌4T1细胞的光热治疗作用

毕 俊，王守巨

0 引 言

光热治疗具有毒性低、空间选择性高的优点，是近几年肿瘤纳米治疗研究的前沿和热点［1］。纳米金三角颗粒具有均一的几何尺寸、高光热转换性能、高比表面积、高生物相容性等优点，具有良好的用于光热治疗的潜力。Bao等［2］将纳米金三角颗粒与RGD多肽连接，用于胃癌的靶向光热治疗。Zhao等［3］将纳米金三角颗粒与P75多肽偶联，用于肺癌的靶向光热治疗和多模态成像。但将纳米金三角用于乳腺癌光热治疗的相关报道较少。本研究将巯基聚乙二醇偶联到纳米金三角颗粒的表面，得到具有良好亲水性和稳定性的聚乙二醇修饰的纳米金三角颗粒（PEGylated Gold Triangular Nanoparticle，PEG-GTN），观察660纳米照射后PEG-GTN对乳腺癌4T1细胞的光热治疗作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器十六烷基三甲基氯化铵（CTAC，TCI公司，中国上海）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、巯基聚乙二醇（分子量2000）、抗坏血酸、碘化钾、氯金酸（Sigma-Aldrich公司，美国）；活-死细胞染色试剂盒（Invitrogen公司，美国）；1640细胞培养基、PBS（Invitrogen公司，美国）；胎牛血清（FBS，Gibco公司，美国）；鼠乳腺癌4T1细胞株（ATCC，美国）；透射电子显微镜镜（JEOL JEM-2100，日本）；660纳米半导体激光器（海特光电有限责任公司，中国）。

1.2 PEG-GTN的制备和表征

1.2.1 合成纳米金三角颗粒取4.8 mL 0.1mol/L的十六烷基三甲基氯化铵溶液、225 μL 0.01 mol/L的碘化钾溶液、241 μL 25.4 mmol/L的氯金酸溶液和59 μL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液加入8 mL去离子水中，混合均匀。再依次加入241 μL 25.4 mmol/L的氯金酸溶液和59 μL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，混合均匀后迅速加入300 μL 64 mmol/L的抗坏血酸，轻微晃动至液体透明。再加入7.5 μL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，剧烈搅动后静置1 h，获得GTN。

1.2.2 纯化纳米金三角颗粒在GTN溶液中加入18 mL 0.5 mol/L的CTAC溶液，混合均匀，静置过夜后弃去上清，再加入1 mL的去离子水，超声分散。

1.2.3 合成PEG-GTN将375 μL 4 mmol/L的巯基聚乙二醇溶液加入1 mL的GTN溶液中，再加入离子水定容至10 mL，涡旋混匀，超声1 h后离心（7000转/min，10 min），沉淀物冻干后得到产物PEG-GTN。部分产物再分散后，用于制备电镜样品。

1.3 PEG-GTN的光热转化效能检测将不同浓度的PEG-GTN水溶液，置于强度为的660纳米激光照射10 min。每隔1 min用光热探头记录水溶液温度。

1.4 PEG-GTN的细胞毒性检测取对数期的乳腺癌细胞株4T1，接种于96孔板上（密度1×104个/孔），培养于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基，并置于37℃、含5%CO2的恒温培养箱中24 h。之后按5、10、20和40 μg/mL浓度加入分别含GTN和PEGGTN的培养基，每个浓度设置5个复孔。共培养24 h后，弃去培养基，每孔加100 μL含有10%MTT（5 mg/mL）的RPMI-1640培养基，并置于培养箱中避光孵育3 h。小心移除孔内培养基后，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，震荡10 min后用酶标仪记录570纳米波长处的吸光度。以未加PEG-GTN的孔作对照，以空白孔调零。细胞存活率计算公式如下：

V＝（A-A0）/（A1-A0）×100%

其中V为细胞存活率，A为受试孔吸光值，A0为空白孔吸光值，A1为对照孔吸光值。

1.5 PEG-GTN的光热治疗作用检测取对数期4T1细胞，按每孔1×104个接种于96孔板上，于培养箱中培养24 h后，按5、10、20和40 μg/mL浓度加入含PEG-GTN的培养基，每个浓度设置5个复孔。共培养24 h后，弃去培养基，PBS漂洗3次后，加入100 μL新鲜培养基后，每孔给予660纳米激光（1 W·cm-2）照射10 min。弃去培养基，每孔加100 μL含有10%MTT（5 mg/mL）的RPMI-1640培养基后，以未加PEG-GTN的孔（仅接受光照）作对照，以空白孔调零，按细胞毒性检测方法，计算细胞存活率。

取对数期4T1细胞接种于96孔板上，培养24 h后，加入新鲜培养基或含40 μg/mLPEG-GTN的培养基，同上处理并光照后，弃去培养基，加入150 μL 2 μmol/L calcein AM，室温孵育45 min后，进行活细胞染色。PBS洗涤并行DAPI复染后，荧光显微镜成像。

1.6 统计学分析采用Graphpad软件进行数据数据。细胞存活率以均数±标准差（xˉ±s）表示，存活率差异采用ANOVA方法进行分析，组间差异利用Tukey HSD方法分析。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PEG-GTN形貌和光热转化效能透射电镜结果显示PEG-GTN具有均一的三角形形貌，边长（56.1±1.3）nm，见图 1。5、10、20和 40 μg/mL PEG-GTN溶液经660纳米激光照射10 min后，溶液温度迅速升高，且温度升高的幅度与PEG-GTN的浓度呈正比。见图2。

图1PEG-GTN透射电镜图Figure 1 The representative TEM image of PEG-GTN

图2 PEG-GTN溶液温度随时间变化曲线Figure 2 The temperature-time curve of PEG-GTN solutions under irradiation of 660 nm laser

2.2 PEG-GTN细胞毒性检测5、10、20和40 μg/mL浓度下GTN与4T1细胞共培养24 h后，细胞存活率分别为（71.2±8.7）%、（72.6±4.6）%、（65.8±2.3）%和（29.9±3.2）%，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明GTN对4T1细胞具有明显的细胞毒性。PEG-GTN与4T1细胞共培养24 h后，5、10、20和40 μg/mL细胞的存活率分别为（96.2±4.4）%、（95.9±4.4）%、（95.2±4.8）%和（96.6±4.7）%，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；但与对照孔的细胞存活率［（100±1.8）%］比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明聚乙二醇保护可以在无光照条件下显著减小GTN对细胞的毒性。

2.3 PEG-GTN光热治疗作用检测5、10、20、和40 μg/mL浓度下PEG-GTN与4T1细胞共培养24 h后，光热治疗结果显示，细胞存活率分别为（92.2±6.2）%、（51.6±6.8）%、（25.7±4.5）%和（4.8±2.5）%，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），10、20、和40 μg/mL时细胞存活率与对照孔［（100±1.8）%］比较差异有统计学意义（P＜0.01）。说明PEG-GTN在660纳米激光照射条件下对乳腺癌4T1细胞存在杀伤作用，且其光热治疗效果与PEG-GTN的浓度相关。Calcein AM活细胞染色结果示，对照孔4T1细胞均显示明亮绿色荧光，说明激光照射本身对细胞无杀伤作用，见图3。与40 μg/mL PEG-GTN共培养并光照治疗后，视野内大部分4T1细胞仅显示标记细胞核的蓝色荧光，说明高浓度PEG-GTN对4T1细胞有良好的杀伤作用，见图4。

图3 4T1细胞Calcein AM和DAPI染色图Figure 3 The Calcein AM and DAPI co-stained section of 4T1 cells

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均高居女性恶性肿瘤首位［4］。同时乳腺作为女性的重要器官，保护其功能和形貌，也是女性的重要健康和心理需要［5-6］。因此寻找创伤小、治疗效果好的新型治疗方法对乳腺癌的治疗具有重要意义。

光热治疗利用纳米颗粒等光热转化剂将激光能量高效的转化为热能，提高肿瘤局部温度，达到杀灭肿瘤的目的，具有空间定位精确、对周围组织损伤小的优点。由于激光在体内的穿透深度有限，所以特别适合用于乳腺癌、头颈部肿瘤等相对表浅的肿瘤。常用的光热转化剂如金纳米颗粒［7］、碳纳米管［8］、石墨烯［9］、普鲁士蓝纳米颗粒［10］、聚多巴胺纳米颗粒［11-12］等，在1 W·cm-2光强激光照射后，肿瘤细胞存活率均可抑制90%以上。本研究使用金纳米三角介导光热治疗，乳腺癌4T1细胞治疗后存活率低于5%，与其它类型光热转化剂报道的治疗效果相近。

本研究结果显示金纳米三角具有均一的三角形形貌，并且尺寸较小，＜100纳米，适合用于静脉注射。此外这种金纳米三角表现出良好的光热转化效能，在光照条件下可以迅速将光能转化成热能，提高周围环境温度。这一升温效应可以杀伤周围的乳腺癌细胞，并且杀伤效果与金纳米三角的浓度成正比。这一结果与前期金纳米棒用于光热治疗杀伤肿瘤细胞的研究结果［13-14］吻合。另一方面，本研究发现金纳米三角在无光照条件下的细胞毒性极小，说明其具有良好的生物相容性。这可能是因为本研究使用巯基聚乙二醇修饰金纳米三角，去除了其表面残留的具有毒性的表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵。

纳米金三角仅在光照区域产生高温杀伤肿瘤，治疗具有空间选择性。但聚乙二醇修饰的纳米金三角本身并不具有乳腺癌靶向能力，是本研究的局限之一。为进一步提高纳米金三角对乳腺癌的体内靶向能力，对特定亚型的乳腺癌（如HER2高表达型），可在纳米金三角表面修饰曲妥珠单抗，以提高其对乳腺癌的特异性杀伤作用［15］。

综上所述，本研究合成了一种具有均一形貌、高光热转化效能的金纳米三角颗粒。实验结果表明，这种颗粒不仅具有良好的生物相容性，细胞毒性低，而且在近红外激光照射下，可以产生热量，有效杀灭乳腺癌4T1细胞，为其进一步用于体外和动物光热治疗研究奠定了基础。