肠道菌群在广谱抗生素降低糖尿病小鼠血糖中的作用研究

郑舟琴，王瑞风，陈俊秀，孙中帅，臧 璞，杜 宏

0 引 言

肠道菌群是寄生在人体肠道中的微生物群落，大约由1000到1500种不同的细菌组成，所包含的基因数至少是人类基因组编码基因的100倍，是人体内一个复杂的微生态系统，在宿主的健康和疾病中扮演了一个重要角色［1］。近年来，糖尿病的患病率正在逐年上升，已经成为世界性的健康问题。众多的研究表明肠道菌群与代谢性疾病尤其是糖尿病有着密切联系，在糖尿病的发生发展中起着重要作用［2-6］。以往的研究已证实抗生素具有显著的降糖作用，但同时也能导致宿主肠道菌群的结构和组成发生明显变化［7-8］。在本研究中，我们主要探讨了广谱抗生素对db/db糖尿病小鼠糖代谢的作用，并进一步阐述了肠道菌群在抗生素发挥降糖作用的过程中可能涉及的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物C57BL/KSJ db/db小鼠由南京大学金陵医院提供。6周龄C57BL/KsJ-db/db小鼠（n=16），体重（32.6±2.4）g，实验动物合格证号：SYXK（军）2007-029，所有的实验动物均以普通饲料喂养，自由进食、饮水，在18～28℃无特殊病原体环境下饲养（12h光照循环）1周以适应环境。

1.1.2 试剂及药物1%纤维素钠溶液（Sigma，USA）；广谱抗生素（万古霉素，羧苄青霉素，甲硝唑，新霉素，Sigma，USA）；戊巴比妥（咪达唑仑，Hoffman La Roche，巴塞尔，瑞士）；DPP-4抑制剂（Millipore，USA，NM_001935.3）；ELISA 试 剂 盒（Millipore，USA，EGLP-35K）；胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)抗体（Abcam，UK，ab22625）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及处理将16只C57BL/KSJ db/db小鼠按随机数字表法分为抗生素组和对照组，每组均为8只。抗生素组：以广谱抗生素［万古霉素10 mg/（kg·d），羧苄青霉素50 mg/（kg·d），甲硝唑50 mg/（kg·d），新霉素30 mg/（kg·d）］处理；对照组：以1%纤维素钠溶液作安慰剂处理。

1.2.2 实验方法研究期间每周记录一次空腹血糖和体重。实验期间，分别在3个不同的时间点（0、3、5周）收集粪便，收集后立即置于-80℃保存备用。5周治疗结束后，处死各组小鼠。在处死时，将小鼠禁食10 h，然后腹腔注射戊巴比妥麻醉，脱颈椎处死后经心房穿刺取血，将血置于含有DPP-IV抑制剂的离心管中。收集小鼠回肠末端（2～3 mm），立即放入含有多聚甲醛或液氮的缓冲液中，以上所有操作均在在冰上进行。用ELISA试剂盒检测GLP-1活性。

1.3 DNA提取与测序CTAB/SDS法提取样本基因组DNA，1%琼脂糖凝胶测定DNA浓度和纯度，并用无菌水将DNA浓度稀释至1ng/μL。选择条形码特异引物（如16S V4：515F-806R）扩增不同区域的16S rRNA基 因（16SV4/16SV3/16SV3-V4/16SV4-V5），所有的PCR反应都是用Phusion®高保真PCR混合物（新英格兰生物实验室）进行的。将同等体积的1X加样缓冲液（含有SYB green）与PCR产物混合，并进行2%琼脂糖凝胶电泳定量检测，选择主条带亮度在400～450 bp之间的样本进行下一步实验。将PCR产物以等密度比混合，然后，用QiAGEN凝胶提取试剂盒（QiEAN，德国）提纯混合PCR产物。根据制造商的建议，使用TruSeq®DNA PCR-Free样品制备试剂盒（Illumina，美国）生成测序文库，并添加索引代码。利用Qubit@2.0荧光仪（ThermoScience）和Agentilent生物分析仪2100系统对文库质量进行了评估。最后，在IlluminaHiSeq2500平台上对文库进行测序，生成250 bp的配对端读数。

1.4 序列分析及物种注释用UPARSE软件进行序列分析（Uparse V7.0.1001），以相似性大于97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），然后对OTUs的代表序列进行物种注释，对于每个代表序列，使用基于RDP 2分类器（版本2.2）算法的GreenGene数据库来注释分类信息。根据物种注释结果，我们选取每个样品在各分类水平（门、纲、目、科、属）上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。对于α多样性，计算香农（Shannon）和辛普森（Simpson）多样性指数，这两个指数都是基于样品的所有OTU丰度和均匀度及其注释的物种信息，反映肠道菌群中所有物种的种类数及每个物种个体数占群落中总个体数比例，指数越大，表示样品中物种越丰富。

1.5 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据用平均值±标准差（xˉ±s）表示，组间均值比较采用t检验。Shannon指数、Simpson指数以均值差（D）表示，相对丰度以平均值表示，以P≤0.05为差异有统计学意义。通过t检验（两独立样本），Wilcoxon秩和检验分析组间物种多样性差异是否显著。群落结构差异分析：LEfSe分析使用LEfSe软件，默认设置LDA Score的筛选值为4。

2 结 果

2.1 抗生素对小鼠空腹血糖的影响结果表明，在前4周，两组小鼠空腹血糖对比均无显著差异（P＞0.05），但在第5周时抗生素组小鼠空腹血糖水平较对照组明显降低［（9.59±4.49）mmol/L vs（19.71±8.74）mmol/L，P＜0.05］。见图1。

2.2 抗生素对小鼠体重的影响抗生素组与对照组小鼠相比，体重均随时间周期的增加而增加，但两组小鼠在各周的体重比较均无明显差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 抗生素对db/db/小鼠肠道菌群结构的影响抗生素组变形杆菌（Proteobacteria）的相对丰度（0.471±0.12）较对照组（0.177±0.12）明显升高（P＜0.05）。其余肠道菌群差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图1 抗生素组与对照组db/db小鼠空腹血糖水平变化Figure 1 Changes of fasting blood glucose level in db/db mice in antibiotic group and control group

图2 抗生素组与对照组db/db小鼠体重变化Figure 2 Weight changes of db/db mice in antibiotic group and control group

图3 抗生素组与对照组在门水平top10物种相对丰度Figure 3 The relative abundance of top 10 species in antibiotic group and control group in the level of phylum

此外，与对照组相比，经抗生素处理的db/db小鼠显著改变了多个OTU聚类。抗生素组变形杆菌门（Proteobacteria）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）显著增多。见图4。

图4 抗生素组与对照组OTU差异显著的LDA值分布柱状图Figure 4 LDA scores（log10）of the OTUs displaying differences between antibiotic group and control group

2.4 抗生素对小鼠肠道菌群多样性及血浆活性GLP-1的影响抗生素组较对照组肠道菌群Shannon指数显著下降（3.135 vs 5.359，P＜0.01），Simpson指数亦下降（0.794 vs 0.946，P＜0.01）。抗生素组较对照组小鼠血浆活性GLP-1（7-36）差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

抗生素的降血糖作用既往也有报道，主要表现为与口服降糖药联用后的强化降糖作用，降糖机制被认为与药代学有关［9-11］。本研究证实广谱抗生素具有单药独立降糖效果。

尽管肠道菌群对宿主代谢的影响在各领域中很少被研究，但他们与代谢性疾病之间的关系却是公认的［12-14］。我们的研究表明，抗生素可显著增加db/db小鼠变形杆菌的相对丰度，且与对照组相比，抗生素组变形杆菌门、肠杆菌科、γ-变形杆菌纲、肠杆菌目增多。既往众多的人类及动物研究报道已证实抗生素能显著增加宿主变形杆菌的相对丰度［15-17］，这与本实验研究结果一致。以往的研究已表明变形杆菌与代谢性疾病尤其是糖尿病密切相关，在糖尿病患者中呈现出一个高度富集状态［3］。但也有研究发现变形杆菌的丰度与糖尿病之间存在一个负相关的关系［18］。我们的研究结果提示变形杆菌的相对丰度在抗生素降低血糖的过程中起重要作用。众所周知，肠道菌群通过发酵膳食纤维产生短链脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs），而短链脂肪酸已被证实可增加胰高血糖素样肽-1和肽YY的水平，从而对宿主的糖代谢产生影响［19-21］。研究表明2型糖尿病患者体内普遍缺乏短链脂肪酸，由此说明短链脂肪酸与糖尿病关系密切［22］。最新的研究发现代表肠道优势细菌的141种产生SCFAs的细菌中，变形杆菌、厚壁菌和放线菌拥有更多能够利用膳食纤维的基因，因而可比其他菌株产生更多的短链脂肪酸［23］。本实验中变形杆菌丰度较对照组显著增加，我们推测抗生素降血糖的机制可能与变形杆菌丰度增加，从而产生更多的短链脂肪酸有关。短链脂肪酸可增加GLP-1水平促进胰岛素分泌而降低血糖，但本实验结果表明抗生素组GLP-1较对照组无明显升高，我们推测短链脂肪酸可能通过其他通路使小鼠血糖改善，相关的研究表明短链脂肪酸也可促进抗炎细胞因子生成，维持免疫稳态，调节2型糖尿病相关的炎症反应，从而改善胰岛素抵抗而降低血糖［24］。

尽管众多的研究已证实了大多数广谱抗生素具有降糖作用，但不同的抗生素对血糖的影响也会有所差异。研究发现不同的喹诺酮类抗生素对血糖波动的影响有所不同，例如左氧氟沙星可降低血糖，但加替沙星却有导致高血糖和低血糖的风险［9］。与此同时，不同的抗生素对肠道菌群也有选择性抑制作用。一项随机安慰剂对照临床试验表明志愿者在随机接受克林霉素、环丙沙星、阿莫西林、米诺环素四种抗生素治疗后可立即观察到肠道菌群组成的变化，但与阿莫西林和米诺环素相比，克林霉素和环丙沙星导致肠道菌群组成及多样性的变化更为显著［25］。此外，抗生素使用疗程的长短也会导致肠道菌群发生不同程度的改变，研究表明抗生素疗程越长，其肠道菌群多样性的降低也越明显［26］。

我们的结果还显示广谱抗生素能显著降低db/db小鼠肠道菌群的多样性，这与以往的研究报道结果一致［27-28］。提示抗生素的使用尽管能够降低血糖，但是可能导致重要的肠道微生物共生体从各群体中消失，从而使能够提供重要健康益处的细菌物种减少［29］。

本研究表明抗生素组与对照组小鼠体重均随周龄的增加而增加，但抗生素组并没有更明显的体重升高效应，两组小鼠体重无显著差异。抗生素影响体重的观点并不鲜见，已有众多的研究明确表明抗生素可增加肥胖的风险，对动物、人类（尤其是新生儿、儿童）体重有显著影响［30，32］。在本研究中，虽然两组小鼠体重均较治疗前有所增加，但可能更多的与本实验小鼠均为先天性肥胖小鼠品系有关，因此我们的结果不能证明抗生素对小鼠体重有增加效应，而更趋向于一个中性作用。另外，既往这些研究中抗生素处理时间均较长，在我们的研究中未发现抗生素组较对照组体重增加，也可能与本实验抗生素使用时间较短，观察时间不够所致，若继续延长实验时间，随着小鼠周龄的增加，两组小鼠的体重曲线也可能出现分离。

综上所述，我们的研究表明，抗生素能显著降低db/db小鼠的空腹血糖水平，改善糖尿病小鼠的糖代谢，机制可能与抗生素改变肠道菌群，增加变形杆菌丰度从而产生更多的短链脂肪酸有关。然而，抗生素在增加变形杆菌相对丰度的同时也降低了肠道菌群的多样性，破坏了肠道内的微生态平衡。抗生素的不规范使用在临床工作中已屡见不鲜，我们需要严格把握抗生素适应证及用法、用量，合理使用抗生素，避免过度使用而导致菌群失调。抗生素的使用或暴露可引起肠道菌群紊乱，尽管它有显著的降糖效应，对代谢性疾病有一定的改善作用，但仍不推荐抗生素在临床上作为降糖药物使用。探索抗生素作用下肠道菌群的改变将有利于相关疾病研究的深入开展，也能进一步推动肠道菌群未来在临床方面的应用。