党参多糖对Ana-1巨噬细胞和小鼠的免疫调节作用

史宝忠 胡建燃 李平 徐凯

（长治学院生物科学与技术系，长治 046011）

党参是我国传统的大宗中药，具有补中益气、健脾益肺等功效。在2015版《中华人民共和国药典》中记载：党参为桔梗科植物党参［Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、 川 党 参（Codonopsis tangshenOliv.）、 素 花 党 参［Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen]等多种同属植物的干燥根［1]。主要有效成分有多糖类、生物碱、皂苷等。其中，党参多糖主要由戊糖、己糖及其衍生物糖醇、糖酸组成，具有抗氧化和抗衰老［2]、调节免疫［3]、促进机体造血［4]的功能，临床可用于降糖降脂等。

目前，针对党参多糖的研究主要集中于提取工艺、含量测定、多糖结构解析以及药理作用方面。在免疫调节方面，已有文献报道了轮叶党参［5]、素花党参［6]、道真洛龙党参［7]等不同品种的党参多糖成分或其制剂对巨噬细胞株释放炎症性因子，以及小鼠［8]、大鼠［9]、肉仔鸡［10]、仔猪［11]等动物的免疫功能的调节活性。本研究以山西省南部道地药材潞党参的多糖为研究对象，分析其对小鼠巨噬细胞Ana-1产生TNF-α和IL-1β的影响，进而通过体内实验，探讨了党参多糖对小鼠免疫器官、血清中炎症性因子等的影响，分析其对免疫功能的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 RPMI-1640培养基购自北京索来宝生物科技有限公司；胎牛血清购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；胰蛋白酶、四氮甲基唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、青链霉素、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）等购自北京依托华茂生物科技有限公司；小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒和小鼠TNF-α ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 材料 党参购自山西省长治市昂生大药房；小鼠巨噬细胞Ana-1购自武汉博士德生物工程有限公司；昆明种小鼠共30只，雌性，每只（20 ± 2）g，由山西康宝生物制品股份有限公司提供。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱（美国热电公司）；细胞计数仪Cellometer Auto1000（美国Nexcelom公司）；多功能酶标仪SpectraMax M2（美谷分子仪器（上海）有限公司）；高速冷冻离心机（HITACHI）。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验 本研究以山西省长治市所产的道地药材潞党参为材料，通过传统的水提醇沉法获得粗多糖，然后通过Sevag 法脱蛋白和透析法除去小分子进行精制，即得党参多糖样品。具体方法参照文献［12]。前期研究显示高于0.25 mg/mL的党参多糖会抑制人宫颈癌细胞SiHa细胞生长［13]，因此本研究以终浓度为0.01、0.03、0.06、0.12和0.25 mg/mL的党参多糖处理小鼠巨噬细胞Ana-1，并参照该文献中的方法，按照1×104个/孔的浓度，将Ana-1细胞接种到96孔板中，用不同浓度的党参多糖处理，每个浓度设置5个复孔。继续培养48 h后，加入MTT溶液，测定OD570值，然后计算细胞存活率。

1.2.2 Ana-1细胞释放TNF-α和IL-1β含量的测定 用不同浓度的党参多糖处理Ana-1细胞48 h后，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作。根据标准曲线来计算小鼠巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.3 动物分组及处理 将小鼠适应性喂养3 d后随机分为5组，每组6只，分别为阴性对照组、阳性对照组及党参多糖高、中、低剂量组。参照文献［7，14-15]，设置阳性对照组灌胃盐酸左旋咪唑（40 mg/kg），高、中、低剂量组分别灌胃0.62、0.31和0.16 mg/g体重的党参多糖，连续灌胃10 d，阴性对照组给予等体积的生理盐水。实验期间各组小鼠自由采食、饮水。

1.2.4 小鼠胸腺指数的测定 将小鼠处死后，取出胸腺，用滤纸吸干后，准确称重，然后按公式：胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）计算各组小鼠的胸腺指数。

1.2.5 小鼠淋巴细胞增殖能力的测定 在无菌条件下，将小鼠脾脏制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2.5×106个/mL，按照每孔 200 μL加入到96孔培养板中。再加入终浓度为2 μg/mL的ConA，同时设空白对照（只加细胞悬液），在37℃、5% CO2培养箱中孵育72 h。取出培养板，每孔中加入 10%的MTT 溶液（储液浓度5 mg/mL），继续培养 4 h后，每孔中加入 100 μL DMSO，振摇 10 min，待紫色结晶完全溶解后，酶标仪读取 570 nm 波长处 OD值。按照公式“淋巴细胞增殖指数 =实验组吸光度值/空白对照组吸光度值”计算细胞增殖指数。

1.2.6 小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的测定 将取得的小鼠血液在室温下自然凝固 15 min，3 000 r/m离心10 min。小心收集上清液，待用。采用 ELLSA法测定小鼠血清中TNF-α和 IL-1β含量。

1.2.7 统计学分析 实验结果以平均值±标准差±s表示。利用SPSS 10.0软件对所得数据进行处理，并进行t检验。

2 结果

2.1 党参多糖对Ana-1细胞存活的影响

分别用终浓度为0.01、0.03、0.06、0.12和0.25 mg/mL的党参多糖处理小鼠巨噬细胞Ana-1 48 h后，利用MTT法检测细胞存活率。结果如图1所示，上述浓度的党参多糖都不影响Ana-1细胞的生长，存活率均接近100%。

图1 党参多糖对Ana-1细胞存活的影响

2.2 党参多糖对Ana-1细胞TNF-α和IL-1β释放的影响

不同浓度的党参多糖处理Ana-1细胞48 h后，取细胞培养上清液，按照试剂盒说明书，分别检测培养液中TNF-α和IL-1β的含量。结果如图2所示，与未加多糖的空白对照组细胞相比较，党参多糖浓度越高，细胞培养液中TNF-α含量越高，当多糖终浓度达到3.13 mg/mL时，TNF-α的释放量显著增多（P＜0.05），当党参多糖浓度高于6.25 mg/mL后，TNF-α释放量增加极显著（P＜0.01）。党参多糖对Ana-1细胞产生IL-1β的影响结果如图3所示，当其终浓度高于6.25 mg/mL时，Ana-1细胞IL-1β产生增加极显著（P＜0.01）。因此，党参多糖能够在体外明显增强小鼠巨噬细胞炎症相关因子的释放量。

图2 党参多糖对Ana-1细胞产生TNF-α的影响

图3 党参多糖对Ana-1细胞产生IL-1β的影响

2.3 党参多糖对小鼠胸腺指数的影响

由表1可知，盐酸左旋咪唑实验组（阳性对照）与生理盐水实验组（阴性对照）相比，胸腺指数明显升高（P＜0.05），表明盐酸左旋咪唑能使小鼠免疫功能增强。与阴性对照组相比，党参多糖中、高剂量组能显著提高小鼠胸腺指数（P＜0.05）。

表1 小鼠胸腺指数测定结果（±s，n=5）

表1 小鼠胸腺指数测定结果（±s，n=5）

注：与生理盐水组相比，*P＜0.05

实验组 胸腺指数（mg/g）生理盐水 4.34±0.45盐酸左旋咪唑（mg/g） 0.04 4.99±0.92*党参多糖（mg/g） 0.16 3.25±0.74*0.31 5.26±0.18*0.62 4.74±0.32*

2.4 党参多糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响

由表2可知，Con A诱导下，与阴性对照生理盐水组相比，阳性对照盐酸左旋咪唑极显著地增强了淋巴细胞增殖指数（P＜0.01）。与阴性对照组相比，中剂量的党参多糖能显著地（P＜0.05）提高淋巴细胞的增殖；高剂量的党参多糖则极显著地增强了淋巴细胞的增殖能力（P＜0.01）。

2.5 党参多糖对小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平的影响

由图4所示，与阴性对照生理盐水组（164.54±26.26 pg/mL）相比，阳性对照盐酸左旋咪唑极显著地提高了小鼠血清红TNF-α的水平（452.25±28.97 pg/mL，P＜0.01）。中剂量和高剂量党参多糖也能极显著提高小鼠血清中TNF-α水平（P＜0.01），分别为264.13±33.56 pg/mL和 377.13±31.85 pg/mL。由图5所示，与生理盐水组（106.60±2.51 pg/mL）相比，中浓度和高浓度的党参多糖极显著增高了小鼠血清中IL-1β的含量（P＜0.01），分别为 132.96±7.10 pg/mL和162.36±9.97 pg/mL。但是，低剂量的党参多糖对小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平的影响，没有显著性差异。

表2 党参多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的影响（±s，n=5）

表2 党参多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的影响（±s，n=5）

注：与生理盐水组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实验组 淋巴细胞增殖指数生理盐水 2.61±0.17盐酸左旋咪唑（mg/g） 0.04 3.61±0.34**党参多糖（mg/g） 0.16 2.55±0.11 0.31 3.32±0.36*0.62 3.93±0.32**

图4 党参多糖对小鼠血清中TNF-α水平的影响

3 讨论

在免疫应答过程中，巨噬细胞通过吞噬作用清除侵入机体的病原微生物，然后通过抗原加工和提呈，从而发挥抗体依赖的免疫作用［16-17]。此外，当巨噬细胞被激活后，还会产生多种细胞因子。如NO、TNF-α、多种白细胞介素等，参与机体多种生理过程。TNF-α是一种参与天然免疫和获得性免疫反应的多功能细胞因子，能激活其他免疫细胞，同时能诱导白细胞趋化运动及其表明黏附分子的表达，从而选择性抑制某些肿瘤细胞。Qin等［18]发现硒化党参多糖能够增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬功能，以及NO、TNF-α和IL-6 的释放，而且可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数，并诱导 TNF-α和 IL-6 的分泌。石轶男等［19]发现党参多糖可能通过NF-κB信号通路增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的TNF-α和IL-6产生。本研究发现党参多糖能有效增强小鼠巨噬细胞Ana-1的TNF-α分泌量，并且前期研究显示当党参多糖浓度高于12.5 mg/mL后，TNF-α分泌量无显著改变。进一步的体内实验也表明，党参多糖显著提高了小鼠血清中TNF-α的含量，接近阳性对照盐酸左旋咪唑的效果，与上述结果一致。

图5 党参多糖对小鼠血清中IL-1β水平的影响

IL-1β是介导炎症反应的一种主要促炎因子，有活化的巨噬细胞分泌产生，可促进B淋巴细胞产生抗体，诱导T淋巴细胞分泌IL-2，且体外实验研究显示，IL-1β可直接杀伤多种肿瘤细胞［20-21]。阎海青等［22]发现蓝莓多酚能抑制RAW264.7细胞中IL-1β的表达；张东芳等［23]的研究显示表没食子儿茶素-3-没食子酸酯可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α和Il-1β的表达，发挥抗炎效应；康峰［24]的研究则显示灵芝多糖能有效促进巨噬细胞分泌IL-1β，增强巨噬细胞活性。本实验发现党参多糖能显著提高巨噬细胞Ana-1的IL-1β分泌量和小鼠血清中IL-1β水平，因此党参多糖可能发挥免疫增强作用。

胸腺和脾脏是人类和动物体内主要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数主要反映了机体非特异免疫能力的强弱。脾脏是机体内最大的淋巴器官和血流通路中的过滤器官，是机体细胞免疫和体液免疫的中心［25]。贾林等［26]研究表明，桔梗多糖能明显增加免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数，显著提高血清中IL-2和TNF-α的含量并呈剂量依赖性。林丹丹等［14]发现党参多糖在硒化后，更能够提高免疫器官指数、淋巴细胞增殖能力和血清免疫球蛋白分泌等作用。本研究发现党参多糖能够显著增强T淋巴细胞的增殖，提高实验小鼠的胸腺指数，并呈剂量依赖关系，高剂量（0.62 mg/g）的党参多糖与阳性对照盐酸左旋咪唑（0.04 mg/g）的效果相当。

4 结论

党参多糖在体外不影响小鼠巨噬细胞Ana-1的增殖，却显著增强其TNF-α和IL-1β的分泌；进一步的体内实验表明，在ConA刺激下，党参多糖能明显促进淋巴细胞的增殖，提高小鼠的胸腺指数及其血清中TNF-α和IL-1β的含量，均呈剂量依赖关系。