羊肚菌挥发性物质综合评价和品质差异分析

兰秀华，谢丽源*，许瀛引，彭卫红，甘炳成

（1.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.电子科技大学生命科学与技术学院，信息生物学研究中心，四川 成都 610054）

羊肚菌（Morchella spp.），隶属子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Pezizomycetes）、羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌属（Morchella）[1]，是一种珍稀名贵食（药）用菌，由于其菌盖表面有不规则多面凹陷皱褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鲜美，肉质脆嫩可口，风味独特，是食（药）用菌中的珍品之一，自古以来一直被奉为宴席上的美味佳肴。除此之外，羊肚菌营养丰富，含有多糖、生物酶类以及钙、锌、铁等多种矿物质[2-3]。已有医学研究表明，羊肚菌有调节机体免疫力、抗疲劳、抑制肿瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等功效[4-12]。

近年来，羊肚菌驯化栽培技术得到迅猛发展，课题组通过10多年努力，选育了国内外首个羊肚菌新品种，集成了羊肚菌配套栽培技术研究，率先实现了羊肚菌大田商业化栽培，为羊肚菌市场提供商品来源。随着羊肚菌人工栽培技术日益成熟，羊肚菌品种日益增多，目前对羊肚菌品种选育大多以外观作为品质标准，以产量作为品种选育指标，并以此来指导生产。羊肚菌中含有独特的香气物质，它是赋予羊肚菌风味的关键因子，也是衡量其品质和品种选育的重要指标。目前国内外对于羊肚菌研究主要集中在菌株生物学特性[13-16]、深层发酵工艺优化[17-18]、多糖提取及纯化[19-22]、种质资源与遗传多样性[23-27]以及生物活性[28]等方面，关于羊肚菌香气物质及品质区分方面的研究鲜有报道。

挥发性物质目前可通过感官评价、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）进行分析鉴定和分类研究。感官评价方式存在极大的人为因素影响，而PCA和CA是近些年用于样品之间区别和聚集最普遍的方式。利用PCA和CA进行羊肚菌品质的综合评价，可避免单一指标的片面性和不稳定性，为样品的利用和品质育种提供重要的科学依据。

本实验采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法检测20 个样品挥发性物质，分析挥发性物质特性，并对挥发性物质的相对含量进行PCA和CA，旨在为品种选育和后期生产加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

20 个羊肚菌子实体，编号为样品1～20，均为梯棱羊肚菌（Morchella importuna）由四川省农业科学院土壤肥料研究所2017年驯化栽培，于同一栽培地点、同一管理栽培模式、同一时期采收样品，经过挑选、烘干，粉碎后密封待用。

1.2 仪器与设备

7890-5975 GC-MS联用仪（配有电子电离源）美国Agilent公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取纤维头 美国Supelco公司；Atomx动态顶空自动进样器 美国Teledyne Tekmar公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME

将粉碎后的样品混合均匀，称取2.00 g试样放置在10 mL样品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL经过煮沸冷却的蒸馏水，摇匀，然后将溶液置于15 mL顶空瓶中，将老化后的萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入GC进样口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析检测。

1.3.2 GC-MS条件

DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.50 μm）；载气：高纯氦气；载气流速（恒流模式）：1.0 mL/min；进样口温度：230 ℃；进样方式：分流进样；分流比：10∶1；升温程序：35 ℃不保持，以5 ℃/min速率升温至220 ℃，保持10 min；离子源温度：230 ℃；扫描模式：Scan；质量扫描范围45～350 u；接口温度：230 ℃；

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 22.0对羊肚菌挥发性物质进行PCA和CA。

2 结果与分析

2.1 不同羊肚菌样品挥发性物质的比较

通过GC-MS分析，共鉴定出81 种挥发性物质，包含8 类挥发性物质：醛类、酮类、酯类、酸类、醇类、杂环类、烃类及其他。由表1可知，醇类、醛类及酮类是20 个羊肚菌样品挥发性物质中最主要的3 类，占总含量的60%～80%。

经过峰的比较筛选，共得到20 个样品的24 个共同峰（表2），这些物质包括：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮异构体、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘。这些物质占总峰面积相对含量平均为77.26%，包含了挥发物图谱中主要的信息。从表2可知，20 个羊肚菌样品中，醛类物质中2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛，酮类物质中薄荷酮及其异构体，醇类物质中3-甲基丁醇相对含量较高，且共有物质中不同样品间各类物质差异较大，醛类物质相对含量为14%～72.42%，醇类物质相对含量为4.7%～23.41%，酮类物质相对含量为4.4%～30.87%，酯类物质相对含量为0.28%～2.55%，烃类物质相对含量为2.62%～13.42%，杂环类物质相对含量为2.86%～15.17%，不含酸类物质。在所有共有物质中，醛类物质相对含量最高，平均达32.19%，其次为酮类物质，平均达到17.33%，再次为醇类物质，平均含量达到11.55%，烃类和杂环类物质相对含量相对较低，分别为6.84%和7.94%，酯类物质相对含量最低，为1.40%。从整体上看，不同样品的挥发性物质变化差异较大，含量变化无明显规律性，而以挥发性物质相对含量的变化为依据对其进行品种筛选和分类不科学，因此，采用PCA和CA的方式对羊肚菌样品进行综合评价和品质区分，便于选择品质类似羊肚菌样品，为羊肚菌品种选育和后期生产加工应用提供参考条件。

表1 不同种类挥发性成分在羊肚菌中的相对含量Table 1 Percentage contents of different classes of volatile compounds in M. importuna%

表2 共有物质种类及相对含量Table 2 Relative amounts of volatile substances simultaneously detected in 20 samples of M. importuna%

续表2 %

2.2 羊肚菌挥发性物质的PCA

表3 PCA特征向量、特征值、方差贡献率及累计方差贡献率Table 3 Eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rates and cumulative contribution rates of the principal components

通过SPSS 22.0软件对20 个羊肚菌样品共有挥发性物质的相对含量进行PCA，结果显示前6 个主成分的累计方差贡献率为90.081%（表3），表明前6 个主成分基本包含了羊肚菌挥发性物质的绝大部分信息，可用于综合品质进行评价。前6 个主成分中，第1主成分的贡献率为33.983%，贡献最大为薄荷酮及其异构体，对应的特征值为0.330和0.331，胡薄荷酮、乙酸薄荷酯、莰酮、桉油精、2-甲基丁醛对第1主成分影响也较大。第2主成分的贡献率为18.567%，贡献最大为正戊醇，对应的特征值为0.393，代表变量有正己醇、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛。第3主成分的贡献率为14.136%，贡献最大为十一烷，对应的特征值为0.389，代表变量有3-甲基丁醇、戊基呋喃、苯甲醛、莰酮、萘。第4主成分贡献率为11.697%，贡献最大为二甲苯，对应的特征值为0.408， 2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、萘对其影响较大。第5主成分贡献率为6.299%，贡献最大为乙醇，对应的特征值为0.664。第6主成分贡献率5.398%，贡献最大为甲苯，对应的特征值为0.585，丁二酮、甲基戊醛、十一烷、桉油精对其影响较大。

以不同特征值的方差贡献率βi（i=1,2,3,……,K）为加权系数，利用综合评价函数F=β1F1+β2F2+β3F3+……+βKFK计算各样本得分，对羊肚菌样本的香气成分进行评价。根据特征值和相应的特征向量，用6 个主成分对不同样品挥发性物质进行综合评价，计算样品的主成分得分，最终基于PCA得到香气评价模型：

F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6

总因子F得分越高，表明品质越好。由表4可知，样品4、20、8、14、12分别居主成分得分的前5 名，表明这5 个样品综合品质表现最好，随后从高到低排序依次为11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

表4 不同羊肚菌样品香气质量评价Table 4 Aroma quality evaluation of different samples

2.3 羊肚菌挥发性物质的CA

采用系统聚类方法，度量标准为平方Euclidean距离，通过组间连接的方式，以共有挥发性物质作为变量，对20 个样品的挥发性物质进行CA，结果见图1。由图1可知，当刻度为15～25时，22 个羊肚菌样品可分为2 个集群，分别是样品4为1 个集群，该样品综合得分为2.872，综合主成分得分排名第1，品质最优，其余19 个样品为1 个集群，综合得分在-1.550～1.481间，综合品质低于样品4；当刻度为10～14时，可分为3 个集群，后1 集群可再分为2 个集群，样品9、17、3、7、19、15、16、1、6、11、18为1 个集群，样品8、14、10、13、2、5、20、12为1 个集群；当刻度在5～10时，在以上分类基础上，还可再细分，集成5 个集群，样品9、17、3、7、19、15、16集成1 个集群，样品1、6、11、18集成1 个集群，样品8、14、10、13、2、5、20集成1 个集群，样品12为1 个集群。CA根据刻度不同可获得多种分类结果，而PCA根据主成分得分仅获得一种分类结果，PCA同CA刻度为15～25时结果相一致，说明通过二者的分析，均可对20 个羊肚菌样品进行分类，通过对菌株进行分类和综合品质评价，可判断同一集群内的菌株香味相似，为菌种选育提供理论依据，从而指导生产。

图1 20 个羊肚菌样品CA树状图Fig. 1 Cluster analysis dendrogram of 20 samples

3 讨 论

食用菌香味物质主要是食用菌在受热过程中产生的多种挥发性风味物质综合平衡的结果，成分差异较大，也比较复杂，主要有不饱和醛酮、醇类、含硫化合物以及一些萜烯类杂环化合物等[29-31]，但每种食用菌均有其独特的挥发性物质。羊肚菌的香气来源于丰富多样的挥发性物质，是羊肚菌具有独特香味的重要原因，也是衡量品质的重要指标之一。目前羊肚菌在驯化过程中常以感官和产量作为品种筛选标准，以外观作为品质指标，以此指标进行商品分级，而忽略了羊肚菌挥发性风味物质对品质的重要影响，导致内在品质参差不齐。在羊肚菌驯化栽培过程中应“量”和“质”兼顾，在考虑产量的同时，挥发性物质也是重要的考察因素，是反映羊肚菌品质的重要指标来源。本实验通过挥发性物质定性定量检测，通过PCA进行综合评价，建立香气评价模型，进一步通过CA进行区分和验证。这种综合指标评价方法可以有效指导羊肚菌生产，提高羊肚菌的商品价值，避免了食用菌研究中常出现的重产量轻品质的现象，是未来食用菌品种选育、栽培工艺研究以及产品加工的重要发展方向。

大量研究表明，挥发性八碳化合物（C8H16O）是食用菌最重要的风味化合物，主要包括1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等，这些物质具有浓烈的蘑菇风味，尤其是1-辛烯-3-醇，普遍存在于大部分食用菌中[31-34]，但在本研究的20 个羊肚菌样品中均未检出，这与1-辛烯-3-醇稳定性低，各种干制方法，包括自然干燥、冷冻干燥、滚筒干燥、喷雾干燥和流化床干燥等都可能对它造成破坏有关[35-36]，但也不排除可能是羊肚菌中不含有1-辛烯-3-醇，它的独特香气与该物质无关，在后续研究有必要进一步扩大样本量，验证该结果。

4 结 论

本研究检测分析了20 个羊肚菌样品中的挥发性物质种类和含量，并采用统计学方法探讨了羊肚菌特征香味物质，根据此研究结果和香气模型可为不同品种的羊肚菌样品提供判定依据，为羊肚菌在品种选育、品质区分及后期产品加工提供参考。

利用HS-SPME-GC-MS对不同来源、不同品种样品的挥发性物质进行定性定量分析，结果表明醇、醛、酮类是羊肚菌挥发性物质最主要的3 类，占总量的60%～80%。

20 个样品中包含了24 个共同物质：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮异构体、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘，这些成分含量的差别造成了不同羊肚菌样本香气的差异性。

基于PCA法构建了羊肚菌综合香气评价模型：F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6，得到不同样品综合品质得分从高到低为4、20、8、14、12、11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

通过CA，在刻度为15～25时，羊肚菌样品可以分为2 个集群，样品4 为1 个集群，其余样品为1 个集群，结果与PCA一致，即综合品质排第1的样品4为1 类，综合品质排2～20的样品归为1 类，由此可见CA法和PCA法能较好地反映羊肚菌样品间的差异性。