绞股蓝中6 种多酚化合物的HPLC检测及其醇提液的抗氧化活性

邓俊琳，朱永清，夏 陈,*，陈 建，赵旭珠，张盈娇，李华佳，邓海云，李 娟

（1.四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川大学华西公共卫生学院，四川 成都 610041）

绞股蓝属（Gynostemma）为葫芦科草质藤本植物，共包括16 个种2 个变种，主要分布于亚洲热带，中国地区主要分布于秦岭以南广大地区[1]。绞股蓝（G. pentaphyllum (Thumb.) Makino）是该属分布最广、资源最丰富的药用植物，为该属的模式物种，有5 叶、7 叶和9 叶等生态类型，以5 叶和7 叶最为常见[2-3]。研究认为绞股蓝含有与人参皂苷相似结构的绞股蓝皂苷，是除五加科外少数被证实含有人参皂苷类成分的植物，因此在医药领域和保健品领域都有很大的市场发展空间[1]。我国对绞股蓝的应用由来已久，民间将其作为野菜食用，同时其又被当作草药治疗咳嗽、痰喘、慢性支气管炎等疾病，是一种经典的药食同源类植物[4]。研究表明绞股蓝含有皂苷、黄酮类、多糖和氨基酸等多种化学成分，具有降血糖血脂[5-7]、免疫调节[8]、抗衰老和保护心血管[9]等作用。在四川绞股蓝属植物有3 种：心籽绞股蓝（G. cardiospermum）、长梗绞股蓝（G. longies）和绞股蓝（G. pentaphyllum），前2 种分布于四川盆地周缘山地，后者则广泛分布于四川盆地和川西南山地[10]。

多酚类化合物是植物中一类物质的统称，因具有多个酚羟基而得名，是植物的次生代谢产物，大多数由苯丙氨酸衍生而来，少部分由酪氨酸衍生而来。按结构大致可分为类黄酮、木聚素、酚酸和木酚素[11]。多酚类化合物在种子萌发、植物生长和发育、细胞分裂、光合作用色素的合成、植物抗霜冻和防御病虫害等过程中均起到重要作用[12-13]。同时对人类健康也具有保护作用，多酚具有预防心血管病发生、抑菌、抗病毒、提高免疫等多种功效[14-16]，且这些活性与多酚的抗氧化活性直接相关[17-18]。目前对绞股蓝中活性成分的研究多集中在绞股蓝皂苷、多糖等，但对绞股蓝中多酚类化合物的研究较少。本实验对四川西南山地野生绞股蓝（生态类型：5 叶、7 叶、9 叶）和人工种植绞股蓝（生态类型：7 叶）叶及茎中多酚单体化合物进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析检测，以及对其醇提液的总多酚含量和抗氧化活性进行研究，以期为绞股蓝的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绞股蓝：2016年4月采收于四川省乐山市峨边彝族自治县，野生绞股蓝：生态类型分别为5 叶、7 叶和9 叶；人工种植绞股蓝：生态类型为7 叶。野生绞股蓝和人工种植绞股蓝经云南省农业科学院药用植物研究所专家李晚谊鉴定并确认。样品存档于四川省农业科学院农产品加工研究所功能食品研究室。干叶和茎粉碎过60 目筛，贮藏备用。

原儿茶素、对羟基苯甲酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚标准品（色谱纯，纯度≥98%），2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS） 北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）、0.22 µm微孔滤膜 美国Mreda公司；甲酸、福林-酚试剂、AlCl3、没食子酸、水溶性VE（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度＞97%） 东京化成工业株式会社。

1.2 仪器与设备

FW-100高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司；TD-4Z型台式低速离心机 四川蜀科仪器有限公司；KH2200DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；ELX-800型号酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；1260型HPLC仪（配有二极管阵列检测器）、poroshell 120 PFP色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）美国Agilent公司；UV-6100型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供试样品溶液的制备

称取绞股蓝粉末0.2 g，加10 mL甲醇，于40 ℃超声提取40 min，甲醇定容至10 mL容量瓶中。0.22 µm微孔滤膜过滤，作为样品HPLC检测的待测液，其余样品用于总多酚含量和抗氧化活性（DPPH、ABTS）的测定。

1.3.2 标准品溶液的制备

溶解原儿茶素、对羟基苯甲酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚标准品20 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL作为标准品母液。采用梯度稀释法用甲醇将各标准品母液配制成一系列质量浓度梯度的标准品溶液，备用。

1.3.3 色谱条件

poroshell 120 PFP色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；检测波长254 nm和350 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL；流速0.8 mL/min；流动相：1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～10 min，5%～10% B；10～20 min，10%～20% B；20～35 min，20%～40% B；35～40 min，40%～70% B；40～45 min，70%～95% B。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 标准曲线、定量限和检出限[19]

精密吸取含有6 种多酚单体的混合标准品，分别稀释2、4、8、16、32、64、128、256、512 倍，在1.3.3节色谱条件下进样测定，计算峰面积。以标准品质量浓度（X，µg/mL）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。并将信噪比为10时相应的质量浓度定为定量线，以信噪比为3时的相应质量浓度确定为检出限。

1.3.4.2 重复性实验

按照1.3.1节的方法平行制备6 份7 叶绞股蓝提取液，按1.3.3节色谱条件进样5 µL进行测定，计算6 种多酚化合物提取量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.3 精密度实验

按照1.3.2节方法制备的标准溶液，按1.3.3节色谱条件连续进样6 次，计算6 种多酚化合物峰面积的RSD。

1.3.4.4 稳定性实验

按照1.3.2节方法制备的标准溶液，按1.3.3节色谱条件对同一样品分别在0、2、4、6、8 h进样5 µL，计算6 种多酚化合物峰面积的RSD。

1.3.4.5 回收率实验

称取绞股蓝样品适量于具塞锥形瓶中，加入6 种标准品适量，按1.3.1节的方法制备7 叶绞股蓝样品，再按1.3.3节色谱条件进样5 µL，并计算6 种化合物的加标回收率。

1.3.5 总多酚含量测定[20]

以没食子酸质量浓度（µg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.002 9X+0.026 3（R2=0.998 2，线性范围17.55～351 µg/mL）。

取100 µL待测液，加3.0 mL蒸馏水摇匀，再加200 µL福林-酚试剂，混匀放置5 min，再加800 µL 10%碳酸钠溶液，避光反应60 min，于波长765 nm处测吸光度。总多酚含量以没食子酸当量计算，单位为mg/g。

1.3.6 DPPH自由基清除活性测定[21]

以水溶性VE质量浓度（µg/mL）为横坐标，清除率为纵坐标，制作标准曲线。得回归方程：Y＝0.942 8X-0.420 2（R2＝0.997，线性范围13～104 µg/mL）。

取200 µL待测液，加2 mL DPPH（0.1 mmol/L）溶液，混匀，避光反应30 min，于波长517 nm处测吸光度。DPPH自由基清除活性以VE当量计算，单位为mg/g。

DPPH自由基清除率按下式计算：

式中：Ax为样品的吸光度；A0为乙醇代替样品时的吸光度。

1.3.7 ABTS阳离子自由基清除活性测定[22]

以水溶性VE的质量浓度（µg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。得回归方程：Y=-0.024 6X+0.515 8（R²=0.998，线性范围0～19.5 µg/mL）。

取400 µL待测液，加1.6 mL ABTS溶液，混匀，避光反应6 min，于波长734 nm处测吸光度。ABTS阳离子自由基清除活性以VE当量计算，单位为mg/g。

1.4 数据处理

所有数据均为3 次重复实验的平均值，应运Microsoft Excel 97-2003和SPSS 20.0对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 多酚标准品溶液和绞股蓝样品的HPLC检测

图1 多酚标准品和野生绞股蓝（7 叶）样品HPLC图Fig. 1 HPLC chromatograms of phenolic standards and phenolics from leaves of wild seven-leaf G. pentaphyllum

从图1A、B可以看出，在此色谱条件下，6 种多酚化合物的标准品得到较好分离，野生绞股蓝（7 叶）的叶样品溶液色谱图（图1C、D）中6 个目标峰的保留时间与标准品溶液的6 个色谱峰保留时间一致。在此色谱条件下，绞股蓝样品中的6 种多酚化合物得到较好的分离。

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线、定量限和检出限结果

表1 6 种多酚化合物的回归方程、线性范围、定量限和检出限Table 1 Regression equations and linear ranges for the 6 phenolic compounds

如表1所示，各种化合物的峰面积和质量浓度之间呈良好的线性关系。

2.2.2 重复性实验结果

6 种多酚化合物提取量的RSD分别为2.23%、4.11%、1.95%、2.51%、4.60%、2.21%，表明实验方法重复性良好。

2.2.3 精密度实验结果

6 种多酚化合物峰面积的RSD分别为2.68%、2.63%、0.89%、1.01%、1.57%、0.69%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性实验结果

6 种多酚化合物峰面积的RSD分别为2.45%、1.80%、0.97%、0.60%、1.47%、0.56%，表明6 种多酚的日内稳定性良好。

2.2.5 回收率实验结果

表2 6 种多酚化合物在绞股蓝样品中的加标回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of phenolic compounds from spiked sample (n= 5)

如表2所示，6 种化合物的加标回收率在84%～99%之间，RSD均小于5%，表明实验方法有较好的回收率，回收结果准确可靠。

2.3 多酚、总多酚含量和抗氧化活性测定

如表3所示，6 种多酚化合物中，芦丁含量均显著高于其他5 种多酚化合物，其次槲皮素含量较高，原儿茶酸和对羟基苯甲酸含量则相对较低。在不同绞股蓝样品中，野生绞股蓝（5 叶）叶中的原儿茶酸、芦丁、槲皮素、山柰酚含量显著高于其他样品。野生绞股蓝（7 叶）叶中对羟基苯甲酸含量、总多酚含量、抗氧化活性高于其他品种，其中，总多酚含量高达75 mg/g，而野生绞股蓝（7 叶）的茎中总多酚含量、抗氧化活性较其他样品低。此外，总多酚含量在绞股蓝中均呈现出叶中含量远高于茎中，且远高于Cai Yizhong等[23]报道的绞股蓝中总多酚含量（4.4 mg/g）。

表3 绞股蓝中6 种多酚、总多酚含量和抗氧化活性Table 3 Contents of 6 phenolic compounds and total phenols and antioxidant activity in G. pentaphyllummg/g

2.4 相关性分析

表4 相关性分析Table 4 Correlation analysis

如表4所示，绞股蓝醇提液对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力均与总多酚含量呈极显著正相关，且二者之间也呈极显著正相关。对DPPH自由基的清除能力与6 种多酚化合物含量呈现极显著正相关。对ABTS阳离子自由基的清除能力与芦丁和异槲皮苷之间无显著相关性，与槲皮素显著正相关，与原儿茶酸和对羟基苯甲酸、山柰酚等均呈现极显著正相关。异槲皮苷含量与总多酚含量之间无显著相关性，总多酚与其他5 种多酚均有显著正相关性。6 种多酚化合物之间，槲皮素与异槲皮苷无显著相关性，对羟基苯甲酸与芦丁、异槲皮苷之间无显著相关性，其余多酚化合物之间均呈现极显著或显著正相关性。

3 讨 论

本研究建立了HPLC法检测绞股蓝中6 种多酚化合物的方法，经验证该方法重复性好（RSD≤4.6%）、精密度高（RSD≤2.68%）、稳定性好（RSD≤2.45%）、加标回收结果准确可靠（RSD≤4.02%），可在35 min内对6 种多酚化合物进行有效分离，峰形对称、分离度高。

植物多酚在植物的生长和发育过程中起到重要的作用，其不仅与种子萌发、细胞分裂、色素合成等密切相关，还能保护植物受伤部位、提高植物对微生物侵袭的抵抗能力[24]。本研究中人工种植绞股蓝（7 叶）的叶中总多酚含量（11.78 mg/g）接近于Šamec等[25]报道的生长于马来西亚和德国的绞股蓝中总多酚的含量（11.57 mg/g和10.42 mg/g），而野生绞股蓝的叶中总多酚含量均较高（均高于30 mg/g），这可能与野生绞股蓝在野外的生长环境有关。此外，6 种多酚化合物之间有显著或极显著正相关，且在同一供试样品的叶中含量均高于茎中，在不同供试样品中，芦丁含量均为最高，原儿茶酸和对羟基苯甲酸含量则相对较低。研究表明影响植物中多酚化合物的组成及含量的因素很多，比如遗传因子、气候因子[26]、土壤因子[27]等，且在同一株植物体上，部位不同，多酚含量也会有所差异[28]。

植物多酚类化合物的抗氧化活性常被作为植物功效评价的重要指标之一。本研究结果表明，DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力与总多酚含量极显著正相关，清除DPPH自由基活性与6 种多酚的含量极显著正相关，但芦丁和异槲皮苷的含量对绞股蓝醇提物的清除ABTS阳离子自由基活性并无显著影响。山柰酚、槲皮素、异槲皮苷和芦丁属于黄酮醇类化合物，研究表明山柰酚在黄烷酮3-羟化酶催化下形成槲皮素，槲皮素经黄酮醇-3葡萄糖转移酶的催化作用形成异槲皮素，异槲皮素再经1,6-鼠李糖基转移酶的催化下形成芦丁[29-30]，但在本实验中异槲皮苷与槲皮素之间并未表现出显著相关性。绞股蓝中黄酮成分可能随产地、气候等差异有所不同，且其药效受到显著影响[31-32]。