高效液相色谱-蒸发光散射法测定翘嘴红鲌肌肉中磷脂的组成

韩迎雪，林婉玲，杨少玲，李来好,3,*，黄 卉，杨贤庆，王锦旭，吴燕燕，翟红蕾，郝淑贤

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300）

翘嘴红鲌（Ergthroculter ilishaeformis）是隶属鲤形目、鲤科、鲌亚科、红鲌属的一种鱼类，俗名翘嘴巴、大白鱼等，是名贵的凶猛性淡水经济鱼类之一[1]。翘嘴红鲌广泛分布于中国各主要水系，具有适应能力强、生长迅速、营养价值高、肉质洁白细嫩、味道鲜美等特点，被称为鱼中上品[2]，深受养殖户和消费者的喜爱，目前市场价格比较高[3-4]。除此之外，还含有丰富的磷脂。磷脂是一类含有磷元素的脂类物质，主要包括磷脂酰胆碱（phosphatidyl cholines，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、二磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol，DPG）以及溶血磷脂酰乙醇胺（lysopnosphatidylethanolamine，LPE）等。磷脂是构成生物膜的重要物质，也是生命的基础物质之一[5]，与细胞的识别、种特异性和组织免疫功能等有着密不可分的联系[6-7]，同时磷脂还是食品的重要营养成分和风味前体物质[8-9]。研究表明，磷脂具有提高记忆、调节血脂、提高免疫力、抗衰老等功能[10-12]。目前有关翘嘴红鲌的研究主要集中于该鱼的生物学[13]、形态分布[14]、人工养殖[15]及其肌肉营养组分[16]等方面。何雄等[17]研究了腌制方式和湿腌温度、时间对翘嘴红鲌肉品质的影响；周丹珺等[18]比较了乳酸链球菌素、山梨酸钾、茶多酚这3 种添加剂对翘嘴红鲌腌制品的保鲜效果；杨立[19]从水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸等方面比较了巢湖野生翘嘴红鲌和养殖翘嘴红鲌肌肉的营养成分并对其营养价值进行评价。但有关翘嘴红鲌肌肉中磷脂的研究鲜见报道，因此对翘嘴红鲌磷脂成分的分析研究具有重要的现实意义。

因此，本实验以翘嘴红鲌为研究对象，采用氯仿-甲醇法提取脂质，纯化后选择高效液相色谱-蒸发光散射检测（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection，HPLC-ELSD）方法，采用梯度洗脱程序测定磷脂组成，旨在为翘嘴红鲌的深入研究和合理开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

翘嘴红鲌（Ergthroculter ilishaeformis）（1.8 kg）8 条，6月在佛山市水产市场进行采样；正己烷、异丙醇（色谱纯） 上海安谱科学仪器有限公司；PE（纯度＞98%）、LPE（纯度＞99%）、PI（纯度＞98%）、PS（纯度＞98%）、SM（纯度≥98%）、PC（纯度＞98%）、LPC（纯度＞98%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT） 美国Sigma公司；氯仿、甲醇、丙酮（均为分析纯） 广州市华屿欣实验器材有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AD HPLC仪、LTII ELSD检测器 日本岛津公司；YP1002N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；TDZ5-WS低速离心机 东莞布鲁斯仪器有限公司；N-EVAP-24氮吹仪 美国Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取翘嘴红鲌背部肌肉，用流动水冲洗后绞碎，备用。

1.3.2 脂肪的提取

淡水鱼肌肉脂肪根据Folch等[20]的方法略作修改后进行提取。准确称取一定质量的绞碎鱼肉于50 mL具塞离心管中，加入15 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液（含0.01% BHT），在冰浴条件下用高速分散均质机以10 000 r/min的转速匀浆2 次，每次15 s，2 次间隔30 s，然后用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液定容至30 mL，静置1 h后过滤，直接将滤液盛放到已知质量的具塞离心管中，加入20%滤液体积的0.85%生理盐水，最后3 000 r/min离心15 min，弃去上层水与甲醇等液体杂质，下层脂质溶液用氮气吹扫有机试剂，冷却至恒质量后称量，得到浓缩脂质。

1.3.3 样品制备

用氯仿-甲醇提取样品中的脂类物质，样品中除含有磷脂外，还含有甘油三酯、游离脂肪酸、胆固醇等物质，这些物质会干扰磷脂的检测，并且有些物质会在硅胶柱上残留积累，使色谱系统的柱压升高，并降低柱效，故样品分析前需进行纯化处理。根据磷脂不溶于丙酮的性质[21]，将1.3.2节得到的浓缩脂质倒入4 ℃的冷丙酮，不断振荡搅拌，待沉淀析出后3 000 r/min离心6 min，除去上清液，冷丙酮清洗沉淀，重复多次，直至上清液无色为止，用氮气吹干制得淡水鱼肌肉磷脂，于-20 ℃冷冻保存，备用。

取适量淡水鱼肌肉磷脂样品，按照一定的质量浓度溶解于甲醇中。HPLC进样前使用0.22 µm孔径有机相滤膜过滤进样品瓶。

1.3.4 色谱条件

HPLC条件：Chromolith®Performan-ce-Si型正相硅胶色谱柱（100 mm×4.6 mm）；柱温箱温度30 ℃；流动相A为正己烷和三乙胺的混合溶液，流动相B为异丙醇，流动相C为13%乙酸溶液；流速为1.5 mL/min，进样量为20 µL。采用三元梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示[22]。

表1 梯度洗脱Table 1 Gradient elution program

ELSD条件：以氮气作为雾化气，气体压强320 kPa，漂移管温度70 ℃。

1.3.5 标准曲线的绘制

PC、PE、PS、PI、SM、LPC和LPE标准品在配制溶液前应放置在-20 ℃贮存。分别准确称取一定量的标准品，PI和LPE用氯仿溶解，其他用甲醇溶解后于棕色容量瓶中定容，配制成标准溶液，标准品溶液配好后使用前置于4 ℃条件下避光保存，现用现配。

将配制好的一定质量浓度的PE、LPE、PI、PS、PC、SM、LPC标准品溶液分别单独进样，记录每个标准品的出峰时间，以相对保留时间对样品中检测出的磷脂进行定性。明确各峰归属后，将各磷脂标准品按一定比例混合成不同质量浓度的标样混合物，质量浓度从低到高多次进样，每样重复进样2 次，以各标准品质量浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，同时确定各组分的最适检测范围。

1.4 数据处理

磷脂分析按其磷脂各标准品的出峰时间确定磷脂的种类，用面积归一化法（以峰值面积的百分比表示）确定磷脂的相对含量[23]。翘嘴红鲌样品平行测定3 次，上述所有数据均用Excel统计，结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化选择

2.1.1 色谱柱的选择

磷脂成分复杂，由一系列极性各不相同的磷脂组分组成，而每种磷脂组分有着不同的端基、分子骨架和脂肪酸链[24]，因此磷脂的定量分析难度较大。综合国内外相关文献[22,25-26]，本实验选用德国默克的Chromolith®Performan-ce-Si型正相硅胶色谱柱（100 mm×4.6 mm）。

2.1.2 检测器的选择

紫外检测器只对具有π键和孤对电子的物质有响应，且其响应值随物质所含的官能团以及官能团的连接方式不同而有差异。磷脂类化合物的紫外吸收很弱，且为末端吸收，干扰较大。ELSD是一种通用型检测器，对大多数物质均有响应，对磷脂的分子种类无特殊要求，因此适用于磷脂类化合物的检测[27]。由于淡水鱼磷脂的组分复杂，是一个极性范围较宽的混合物，采用通常的等度洗脱体系很难将磷脂的各个组分完全分离，且分析时间较长[28]。磷脂类物质本身不含发色基团，而且也无较好的衍生化处理技术。为了提高分离效果，缩短分析时间，选择ELSD检测。

2.1.3 流动相的选择

在磷脂化合物的分离和测定中，常见的流动相体系有甲醇[29]、乙腈-甲醇-85%磷酸[30]和正己烷-异丙醇-乙酸溶液[31-32]。最常用的是第3类流动相，这是由于该流动相体系具有良好的色谱分离效果，并且溶剂不易挥发，同时考虑到柱子寿命问题，最终选用正己烷-异丙醇-乙酸溶液体系作为流动相。

2.1.4 柱温的选择

在1.3.4节条件下，考察柱温对磷脂分离效果的影响，结果见图1。在25～40 ℃之间对7 种磷脂的分离影响较小。但在25 ℃和40 ℃时，PE的色谱图峰形不好，30 ℃和35 ℃时PE的峰形较好。考虑到温度过高磷脂易发生变性，故选择的柱温为30 ℃。

图1 不同柱温下7 种磷脂混合标准品的HPLC-ELSD图谱Fig. 1 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids at different column temperatures

2.1.5 ELSD漂移管温度的选择

参考ELSD漂移管温度的设置原则，考察相同色谱条件下ELSD漂移管温度分别为50、60、70、80 ℃时对磷脂标准品分离结果的影响，结果见图2。50 ℃时PE峰形不好，80 ℃条件下基线噪音比较大，综合各磷脂标准品峰形，最终选择ELSD漂移管温度为70 ℃。

图2 不同漂移管温度下7 种磷脂混合标准品的HPLC-ELSD图谱Fig. 2 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids at different drift tube temperatures

图3 7 种磷脂混合标准品（A）和翘嘴红鲌（B）的HPLC-ELSD图谱Fig. 3 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids (A) and phospholipids from E. ilishaeformis (B)

在1.3.4节色谱条件下，标准品和翘嘴红鲌样品出峰时间均可以在15 min内全部完成，结果见图3，混合磷脂标准品的所有磷脂组分均能达到基线分离呈现单峰，LPC呈现前肩峰，计算峰面积时按两峰面积相加之和来算，这是由于随磷脂分子结构中酯基上烃基链长短和双键位置的不同，每种磷脂又可分为许多分子种类，因而在某一色谱条件下，某一种磷脂组分的谱峰可能会出现拖尾或出现肩峰，甚至分出2 个或更多的峰[33]，但并不影响各磷脂的分离与定量分析，计算峰面积时按两峰面积相加之和来算。

2.2 标准曲线及线性范围

实验中进样量为20 µL，在实验所选定的检测范围之内，得到的各磷脂标准曲线如表2所示，结果均为线性关系，且相关系数R2均大于0.99。通过线性参数的确定，可以对试液制备的稀释倍数进行调整，以便减少测定误差。

表2 磷脂标准曲线方程及R2值Table 2 Equations and R2 values of calibration curves for phospholipid standards

2.3 方法的精密度结果

对含有PC、PE、PS、PI、SM、LPC和LPE 7 种标准品的混合溶液，同一质量浓度重复进样3 次，记录每次的峰面积，计算出各磷脂组分对应的峰面积的均值与变异系数，结果见表3。由此可知，各个磷脂标准品的峰面积重复性很好，变异系数值均小于3.0%。

表3 磷脂标准品峰面积的重复性Table 3 Reproducibility of detector response to phospholipid standards

2.4 回收率结果

准确称取相同的淡水鱼肌肉样品4 份，每份2 g。其中3 份加入已知量的磷脂标准品，涡旋混匀，配成新样品，另1 份不加，按1.3.2节和1.3.3节方法处理，用1.3.4节色谱条件每份平行测定3 次。根据线性标准曲线方程计算出各磷脂组分的加样回收率，结果见表4。从表4可以看出，平均回收率为 88.38%～107.41%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.40%～4.95%，达到了检测要求。

表4 磷脂的加标回收率Table 4 Recovery of phospholipids from spiked samples

2.5 翘嘴红鲌磷脂分析

在1.3.4节色谱条件下，利用HPLC-ELSD对翘嘴红鲌肌肉的磷脂组成进行测定，将测得的峰面积带入线性回归方程，计算各磷脂的相对含量，结果见表5。

表5 翘嘴红鲌磷脂组成及相对含量Table 5 Composition and relative contents of phospholipids in E. ilishaeformis%

从表5可以看出，翘嘴红鲌肌肉中共检测出5 种磷脂，分别为PE、PI、PS、PC和SM，其中PE、PI和PC是翘嘴红鲌肌肉磷脂的重要组成成分，相对含量顺序为PE＞PI＞PC。PE作为构成生物膜的重要组成部分，具有维持生物体结构和功能的作用，影响着一系列生物代谢活动，如调节血压、视觉活动等[34]；PI在细胞的各种生理功能起着非常重要的作用[35]；PC具有预防和辅助治疗动脉硬化、改善记忆力、延缓衰老等功能[36-37]。饮食中适当增加翘嘴红鲌淡水鱼的摄入量，对人体健康有很大的益处。

3 结 论

本实验参考卢航等[22]的洗脱条件，通过优化柱温和ELSD参数，得到HPLC-ELSD测定翘嘴红鲌肌肉磷脂的方法，该方法可以准确检测翘嘴红鲌肌肉中各磷脂组成，样品的分离度高，方法精密度高，变异系数均小于3.0%，平均回收率为88.38%～107.41%，RSD为0.40%～4.95%，达到了检测要求。

方法所用试剂配制简单，样品中磷脂的提取过程操作简便，且损失很少，所以利用本方法检测淡水鱼中的磷脂操作更为简单，结果更为准确，可以满足日常磷脂的检测要求。

虽然该方法是针对翘嘴红鲌肌肉磷脂检测建立的，但由于磷脂是较复杂的体系，且一般认为鱼类磷脂组分很相近，因此该方法也适用于其他淡水鱼磷脂成分的检测。