利用坛紫菜藻红蛋白制备脯氨酰内肽酶抑制肽

谢雪琼，钟 婵，孙乐常,2，翁 凌,2，张凌晶,2，刘光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021）

脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）也称脯氨酰寡肽酶，是一种能特异性水解低分子质量多肽链（＜30 个氨基酸）羧基端脯氨酸残基的细胞内丝氨酸蛋白酶。在哺乳动物中，PEP参与组织中多种生理功能[1-2]，如学习和记忆、细胞分裂与分化、信号转导、蛋白质分泌，可降解Substance P、激素样肽、神经活性肽等[3-6]。当PEP表达水平上调时，通常会导致一些神经性疾病，如阿尔兹海默症、健忘症、抑郁症和精神分裂症的发生[7]。PEP三级结构模型[8-9]显示，其催化结构域由α/β-折叠组合，其中C末端共价连接七叶-β-螺旋桨非催化域，两区域界面的空腔形成该酶的活性位点。因为β-螺旋桨结构的存在，形成了PEP只能酶切小分子质量多肽链的特点，也为PEP抑制剂（肽）的制备和设计提供了依据。目前，普拉西坦、JTP-4819[10]、S-17092[11]和KYP-2047[12]等化学合成的PEP抑制药物，在神经保护和认知增强方面均已表现良好的临床治疗效果[13]。由于化学合成药物可能有不可预估的药理副作用，近年来天然来源的PEP抑制肽受到关注。Sila等[14]发现，酸性蛋白酶水解鲃属鱼（Barbus callensis）鱼皮明胶产物可显著抑制PEP的活性。Martinez-Alvarez等[15]发现，模拟胃、肠液消化后的沙丁鱼和金枪鱼肌肉蛋白水解液也具有PEP抑制效果。Hsieh等[16]从酪蛋白钠酶解液中分离得到多种高活性的PEP抑制肽。Hellinger等[17]也从九尾属的草药中分离得到对人PEP具有抑制作用的植物源天然环肽。Manzanares等[18]发现，乳铁蛋白源PEP抑制肽PKH8和PKH11对PEP表现出抑制能力，而这种抑制还能消除神经母细胞瘤细胞中β淀粉样肽的形成。以上研究均表明，动物和植物源的生物活性肽是抑制PEP活性的潜在物质。

坛紫菜（Porphyra haitanensis）是福建省特色优势海洋藻类，具有较高的经济价值。据统计，2016年福建省紫菜养殖面积1.7万 公顷，年产量达6.6万 t[19]。紫菜含有丰富的营养成分，如蛋白质、多糖、脂类、维生素和矿物质等。藻胆蛋白是红藻和蓝藻特有的捕光色素蛋白，它包括藻红蛋白（R-phycoerythrin，R-PE）、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及藻红蓝蛋白4 种色素蛋白。紫菜中R-PE含量较高，最高可达干质量的2.43%[20]。

近年来，国内外以动植物源蛋白为原料利用酶法制备生物活性肽的报道较多，特别是与高血压相关的血管紧张素转移酶抑制肽[21-26]。本课题组也利用胃、肠液蛋白酶对红毛藻R-PE分解并分离制备了2 种血管紧张素转移酶抑制肽[27]。但红毛藻原料价格昂贵，制备活性肽成本高。坛紫菜中R-PE含量丰富，且以坛紫菜为原料制备PEP抑制肽的研究还鲜有报道。此外，采用非胃、肠液蛋白酶制备的活性肽尽管在体外具有生物活性，但人体摄入经胃、肠液进一步消化后其活性会有所改变。因此，本研究拟以坛紫菜为研究对象，探讨胃、肠液蛋白酶对其消化特性，分析消化产物的PEP抑制活性，并优化制备PEP抑制肽的酶解条件，以期为坛紫菜高值化利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干坛紫菜购于厦门市集美区新华都超市。

DEAE-Sepharose阴离子交换层析树脂 美国GE Healthcare公司；荧光底物succinylglcyl-L-proline 4-methylcoumaryl-7-amide（Suc-Gly-Pro-MCA） 日本Peptide Institute公司；猪胃蛋白酶、猪胰凝乳蛋白酶美国Sigma-Aldrich公司；猪胰蛋白酶 上海麦克林生化科技有限公司（中国）；高纯度猪脑PEP 本实验室制备；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）用标准蛋白 美国Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26S XP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；Lamda 35紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司；FP-6200荧光分光光度计 日本Jasco公司；凝胶成像仪 英国Syngene公司；ND-100微量蛋白核酸测定仪 德国NanoDrop公司；Starter 3100 pH计 美国Ohaus公司；AKTA Basic UPC 10蛋白质及多肽纯化装置 美国GE Healthcare公司；1260VL高效液相色谱仪 美国Agilent公司；恒温水浴锅 德国Memmert公司；蛋白质电泳装置 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 坛紫菜模拟胃、肠液消化

模拟胃、肠液消化实验模拟胃、肠液配制参考美国药典[28]的方法。胃液配制：1 L模拟胃液中含2 g氯化钠，用1 mol/L盐酸调pH 1.2；肠液配制：1 L模拟肠液中含6.8 g磷酸二氢钾，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH 7.5。

坛紫菜体外模拟胃、肠液消化实验参照黄园园等[29]的方法，胃蛋白酶（≥250 U/mg）、混合酶（即胰蛋白酶（250 U/mg）和胰凝乳蛋白酶（≥40 U/mg）质量比为1∶1）与坛紫菜粉末的比例为1∶50（m/m）。将20 g坛紫菜粉末与400 mL超纯水混合后组织捣碎机匀浆10 min，然后将匀浆液稀释50 倍后待用。模拟胃液消化：取已稀释均浆液4 mL于15 mL离心管，在37 ℃恒温水浴预热10 min后，加入0.08 mg/mL胃蛋白酶1 mL，振荡混匀，反应60 min后立即加入300 μL 0.2 mol/L碳酸钠溶液，调整pH 7.5，终止反应，该反应液为模拟胃液消化产物；模拟肠液消化：模拟胃液消化产物，继续加入1 mL含混合酶（0.08 mg/mL）的模拟肠液，37 ℃反应120 min后，在95 ℃加热5 min使混合酶失活，终止反应。测定坛紫菜模拟胃、肠液消化产物的PEP抑制活性。

1.3.2 R-PE的分离纯化

坛紫菜R-PE的分离纯化参考付晓苹[30]的方法。坛紫菜与蒸馏水按1∶20（g/mL）比例混合，经反复冻融、组织匀浆等处理以充分破碎细胞，制成坛紫菜R-PE粗提液。离心后取上清液，进行35%～50%硫酸铵盐析，沉淀复溶于20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 5.6），并用相同缓冲液透析，将透析后的样品上样于预先用20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 5.6）平衡好的DEAE-Sepharose阴离子交换层析柱（2.5 cm×10 cm），上样结束后用平衡缓冲液流洗层析柱直至洗脱液在波长280 nm下的紫外吸光度低于0.05，再用20 mmol/L磷酸缓冲液（含0.05 mol/L氯化钠，pH 5.6）和20 mmol/L磷酸二氢钠溶液（含0.2 mol/L氯化钠）进行线性洗脱。

纯化样品冷冻干燥后于-20 ℃贮存备用。利用Tricine-SDS-PAGE[30]和吸光度A565nm/A280nm分析样品纯度，在400～700 nm波长范围内对纯化的样品进行光吸收值扫描分析紫外-可见光吸收光谱特性。

1.3.3 蛋白质含量测定

纯化过程中，使用微量蛋白核酸测定仪测定样品在280 nm的吸光度；纯化的R-PE使用Bradford法测定其蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.3.4 酶法制备PEP抑制肽的条件优化

利用主要消化酶（胃蛋白酶和混合酶）分步酶解纯化的R-PE制备PEP抑制肽。在模拟胃、肠液消化的基础上，分析不同含量蛋白酶和酶解时间对PEP抑制活性的影响。

第1阶段酶解，选取胃蛋白酶和纯化的R-PE（1 mg/mL）比例（m/m）为：0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%，在37 ℃对R-PE酶解60 min，测定不同水解液的PEP抑制活性，确定最适的胃蛋白酶添加量。在最适胃蛋白酶添加量下对R-PE酶解0、1、2、5、10、15、30、60 min，测定不同水解液的PEP抑制活性，以确定最佳的胃蛋白酶酶解时间。

利用以上优化的条件对R-PE（1 mg/mL）进行酶解，将水解产物进行第2阶段酶解，选取混合酶和纯化的R-PE（1 mg/mL）比例（m/m）为0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%，在37 ℃恒温反应120 min，测定不同水解液的PEP抑制活性，确定最适的混合酶添加量。之后，再做进一步探究，以确定混合酶的最佳反应时间。

1.3.5 PEP抑制活性测定

参考Hellinger等[17]方法略作修改。具体方法如下：将100 μL质量浓度为40 μg/mL的PEP（28.7 U/mg）置于750 μL 25 mmol/L磷酸缓冲液（含4 mmol/L β-巯基乙醇，pH 6.0）中，加入100 μL R-PE水解液，30 ℃恒温反应15 min。加入50 μL浓度为10 μmol/L的荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA，充分混匀，37 ℃恒温水浴反应30 min后，用1.5 mL终止液（甲醇-异丙醇-超纯水（35∶30∶35，V/V））终止反应。采用荧光分光光度计测定反应荧光底物释放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的荧光强度，测定的激发波长和发射波长分别为380 nm和450 nm。对照组以100 μL 25 mmol/L磷酸缓冲液替换R-PE水解液。

式中：A为实验组的荧光强度；B为对照组的荧光强度。

R-PE水解液的IC50测定参考Hsieh等[16]方法，并略作修改。根据以上方法，测定不同质量浓度R-PE水解液的PEP抑制率。以不同质量浓度R-PE水解液为横坐标和对应PEP抑制率为纵坐标作图分析。

1.3.6 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGE分析

R-PE的水解效果采用Tricine-SDS-PAGE分析，主要参考Schãgger[31]的方法。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液对凝胶染色，之后，用脱色液脱色至蛋白条带清晰，用凝胶记录仪记录结果。

1.3.7 R-PE水解液分子质量分布比例测定

采用高效凝胶过滤色谱法，参考伍强[27]的方法，略作修改。相对分子质量校正曲线所用标准品如下：鱼小清蛋白II，11 950 Da；50肽（HDGKGLFYNSYPDQEG KSDGTETSTNLHQKLYYHVLGTPQSEDVLCAEFP），5 617.97 Da；杆菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。

色谱条件：GF-1260 Agilent HPLC，纯化系统；色谱柱为TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流动相为乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；紫外检测波长220 nm；进样体积10 μL（标准品）和50 μL（待测样品）；流速1 mL/min；柱温25 ℃。所得数据利用GPC Offline软件进行分析，确定样品分子质量的分布比例。

1.3.8 R-PE水解液对PEP的抑制类型及抑制常数分析

参考陈清西[32]的方法，并略作修改。

抑制类型分析：分别取100 μL不同质量浓度PEP（0、5、10、20、30、40 μg/mL）置于750 μL、25 mmol/L磷酸缓冲液（含4 mmol/L β-巯基乙醇，pH 6.0）中，与100 μL不同质量浓度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL）混合，再加入50 μL浓度为10 μmol/L的荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA，充分混匀，在37 ℃恒温水浴反应5 min后，加入1.5 mL终止液终止反应。用荧光分光光度计测定反应荧光底物释放的AMC，由此计算反应的初速率，以PEP质量浓度对反应速率作图，分析R-PE水解液对PEP的抑制类型。

抑制常数的测定：分别取100 μL 20 μg/mL PEP置于750 μL 25 mmol/L磷酸缓冲液（含4 mmol/L β-巯基乙醇，pH 6.0）中，加入100 μL不同质量浓度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL），再加入不同浓度荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA（0、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L），充分混匀，在37 ℃恒温水浴反应5 min，终止反应。计算酶促反应初速率，通过Lineweaver-Burk双倒数作图法计算R-PE水解液对PEP的抑制常数。

1.4 数据分析

本研究有关PEP抑制数据处理中，以同一组内3 个重复样品的平均变异系数为组内误差进行分析。利用SPSS Statistics 17.0计算机程序对实验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 坛紫菜模拟胃、肠液消化

坛紫菜经体外模拟胃、肠液消化后，水解产物的PEP抑制活性结果如图1所示。消化60 min后，产物中PEP抑制活性显著提高；继续经模拟肠液消化120 min后，终产物的PEP抑制活性没有明显变化。由此可知，坛紫菜中的蛋白质是PEP抑制活性肽的潜在资源，且胃、肠液，特别是胃液消化有助于提高其对PEP的抑制活性。

图1 坛紫菜模拟胃、肠液消化产物的PEP抑制活性Fig. 1 PEP inhibitory activity of P. haitanensis hydrolysates from simulated gastrointestinal digestion

2.2 R-PE的分离纯化

由表1可知，坛紫菜经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，分离得到R-PE，纯化倍数为6.0 倍，得率达17.0%。该R-PE纯度系数（A565nm/A280nm=5.4）较红毛藻源R-PE（A565nm/A280nm=5.1）高[27]，达到试剂级（＞4.0）[33]，但其得率较红毛藻源R-PE（43.4%）低。对纯化R-PE进行紫外光谱特性和Tricine-SDS-PAGE分析，结果如图2所示。其中，紫外-可见吸收光谱特性（图2a）与文献报道的坛紫菜源R-PE在499 nm和565 nm波长处均有最大特征吸收峰基本一致。Tricine-SDS-PAGE分析（图2b）发现纯化R-PE有3 个亚基α、β和γ，分子质量分别为21、22、32 kDa，与付晓苹[30]报道坛紫菜R-PE的SDS-PAGE结果一致。以上结果表明，通过硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等技术分离纯化可得到高纯度的R-PE。

表1 坛紫菜R-PE的纯化结果Table 1 Summary of purification of R-PE from P. haitanensis

图2 坛紫菜R-PE紫外-可见光吸收光谱图（a）和Tricine-SDS-PAGE图（b）Fig. 2 UV absorption spectrum (a) and Tricine-SDS-PAGE (b) of purified R-PE from P. haitanensi

2.3 酶法制备PEP抑制肽的条件确定

2.3.1 胃蛋白酶比例及消化时间的确定

图3 第1阶段酶解胃蛋白酶添加量（a）及酶解时间（b）对R-PE水解液PEP抑制活性的影响Fig. 3 Effect of pepsin dosage (a) and digestion duration (b) on the PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate

由图3a可知，随着胃蛋白酶比例增加，R-PE消化产物中PEP抑制活性明显增加，当胃蛋白酶和R-PE比例为0.5%（m/m）时，其水解产物中PEP抑制活性最强。但继续增大加酶量，产物对PEP抑制活性不再增加，推测在该条件下R-PE中胃蛋白酶的酶切位点已被充分酶解，由此确定胃蛋白酶添加量为0.5%。

进一步分析酶解时间对R-PE水解产物的PEP抑制活性影响，如图3b所示，在30 min内，R-PE水解产物的PEP抑制活性随酶解时间延长而逐渐增强，且在酶解时间为30 min时R-PE水解产物中PEP抑制活性最强；继续延长时间，在30～60 min范围，酶解时间对R-PE水解液中PEP抑制活性影响较小。由此可知，利用R-PE酶法制备PEP抑制肽的第1阶段酶解条件为：胃蛋白酶与R-PE比例0.5%（m/m）、酶解时间30 min，pH 1.2，温度37 ℃。

2.3.2 混合酶比例及消化时间的确定

图4 混合酶添加量（a）及酶解时间（b）对R-PE水解液PEP抑制活性的影响Fig. 4 Effect of T + C dosage (a) and digestion duration (b) on the PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate

利用2.3.1节优化的酶解条件对R-PE进行第1阶段酶解后将水解产物进行第2阶段酶解，不同比例混合酶对消化产物中PEP抑制活性的影响如图4a所示，混合酶与R-PE比例为0.25%（m/m）时，终产物的PEP抑制活性最强，继续增大加酶量的水解产物对PEP抑制活性反而有下降趋势，推测模拟胃液消化产生的某些活性肽被混合酶过度降解可失去PEP抑制活性。

在R-PE中加入0.5%胃蛋白酶，酶解30 min后进行第2阶段酶解，混合酶添加量为0.25%，研究酶解时间对产物的PEP抑制活性影响，如图4b所示，当连续酶解至60 min时，终产物的PEP抑制活性最强。由此可知，利用R-PE酶法制备PEP抑制肽的第2阶段酶解条件为混合酶与R-PE比例0.25%（m/m）、酶解时间30 min、pH 7.5、温度37 ℃。

2.4 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGE分析

图5 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGEFig. 5 Tricine-SDS-PAGE pattern of R-PE hydrolysate

如图5所示，与酶解前的蛋白（泳道C）相比，胃蛋白酶和混合酶对R-PE均有明显的消化作用。在胃蛋白酶酶解5 min后，R-PE的α亚基、β亚基、γ亚基发生显著的降解；酶解5～30 min范围内，水解产物被胃蛋白酶继续降解；之后，进行第2阶段酶解，在30～60 min范围进一步被降解为更小分子的产物，而在90～150 min范围，酶解变化不明显，与图4b 60～150 min的水解产物PEP抑制活性差异不显著结果一致。

2.5 R-PE水解液的分子质量分布

表2 R-PE酶解产物的分子质量分布及所占比例Table 2 Molecular mass distribution of R-PE hydrolysate

如表2所示，由GPC软件分析可知，R-PE在酶解过程中，酶解产物的蛋白分子质量变化是一个渐进的过程。R-PE是由分子质量分别为21、22、32 kDa的3 个亚基α、β和γ组成的蛋白质，第1阶段酶解后，65.94%酶解产物的分子质量小于3 kDa；继续酶解，到第2阶段水解完毕，分子质量低于3 kDa的酶解产物的比例增至86.06%，分子质量高于5 kDa的酶解产物的比例由24.30%降至4.52%。R-PE酶解产物的分子质量分布色谱图如图6所示，比较图6a与图6b，经过第1阶段胃蛋白酶酶解的R-PE，在第2阶段经混合酶得到进一步水解，特别是对分子质量大于5 kDa产物的酶解作用效果显著。由此知，经过两步酶解的R-PE几乎被完全水解，表明利用胃蛋白酶、混合酶对R-PE进行分步酶解，可制备出低分子质量、较高活性的R-PE源PEP抑制肽。

图6 胃蛋白酶（a）和混合酶（b）R-PE酶解产物的分子质量分布Fig. 6 Molecular mass distribution of peptide fractions from R-PE hydrolysate

2.6 R-PE水解液的PEP抑制活性

图7 不同质量浓度R-PE水解液的PEP抑制活性Fig. 7 PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate at different concentrations

根据PEP抑制活性的检测方法，将R-PE水解液稀释为不同浓度，分别测定对PEP的抑制率。以不同质量浓度R-PE水解液（31.25～666.67 μg/mL）为横坐标，对应的PEP抑制率（13.59%～88.40%）为纵坐标作图分析，结果如图7所示。R-PE水解液的PEP抑制活性IC50为136.35 μg/mL，低于其他动物来源的PEP抑制肽的IC50，如沙丁鱼鱼头水解液IC50（9 570±1 480）μg/mL[15]、金枪鱼鱼头水解液IC50（3 300±1 050）μg/mL[15]、酪蛋白钠水解产物IC50（770 μg/mL）[16]、乳铁蛋白源PEP抑制肽PKH11的IC50（2 100±200）μg/mL[18]。因此，经胃蛋白酶和混合酶酶解的R-PE水解产物具有更显著的PEP抑制活性。

2.7 R-PE水解液对PEP的抑制类型及抑制常数分析

图8 R-PE水解液对PEP的抑制动力学Fig. 8 Kinetic study on inhibition of R-PE hydrolysate on PEP

图8 A显示不同质量浓度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL）作用PEP的抑制动力学曲线均为通过原点的直线，可知R-PE水解液对PEP的抑制作用是可逆过程。如图8B所示，不同质量浓度R-PE水解液存在时Lineweaver-Burk双倒数曲线相交于X轴，说明R-PE水解液对PEP表现为非竞争性抑制。进一步运用二次作图法，以双倒数图的斜率对R-PE水解液质量浓度作图，从横轴截距可求出其抑制常数Ki为14 μg/mL。与从酪蛋白钠酶解液中分离得到9 种PEP抑制肽[20]的竞争性抑制类型不同，R-PE水解液对PEP的抑制属于可逆非竞争性抑制，说明R-PE水解液中PEP抑制肽没有与PEP酶催化区域结合而是作用于其他位点，形成中间复合体从而抑制PEP的活性。

3 结 论

本研究以福建高产的坛紫菜为原料，利用硫酸铵盐析和离子交换技术获得高纯度藻红蛋白，为对该蛋白的食品学功能分析创造了条件。利用胃、肠液消化酶分步酶解坛紫菜R-PE，并优化酶解条件获得PEP抑制肽的制备工艺。采用Tricine-SDS-PAGE验证酶解效果，凝胶过滤色谱法测得R-PE水解液中分子质量在3 kDa以下的小肽含量为86.06%。制备的R-PE酶解液通过可逆非竞争性抑制模式对PEP表现较高的抑制活性，其IC50为136.35 μg/mL。紫菜中含量丰富的R-PE是潜在的PEP抑制活性肽来源，今后有必要对PEP抑制肽进行分离纯化并解明它们的结构。本研究为坛紫菜作为功能性食品的高值化利用提供了理论参考。