血浆miRNA-200b及miRNA-21在浆液性卵巢癌中的表达特点分析

郝文涛 杨亚玲 张海雁

卵巢癌是当前妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因，由于在早期缺少典型的症状，被确诊时大都处于肿瘤晚期，5年生存率维持在30%左右[1-2]。浆液性卵巢癌为具有恶性潜能的卵巢上皮性肿瘤，也是卵巢癌的常见类型，具有间质细胞瘤特征，当前在我国的发病有逐年升高的趋势[3]。当前对于浆液性卵巢癌缺乏早期有效的诊断方法，找到一种有效的早期生物学标志物是目前临床研究的重点[4]。MircoRNAs(miRNAs)是长21～23 nt的非编码短链RNA，通过碱基配对的方式作用于相应靶mRNA，导致靶mRNA转录后抑制或降解[5-6]。miRNAs通过参与调节细胞分化、细胞增殖凋亡等多种途径在肿瘤发生、发展中发挥重要的生物学作用[7-8]，特别是miRNAs可通过靶向诱导作用于转录因子和细胞信号传导途径系统中，调控下游靶基因的转录和翻译[9]。卵巢癌组织、患者血清及外周血小体中检测到多种miRNAs的异常表达，其中表达有显著变化的有miRNA-200b及miRNA-21、miR-125b、miR-140等[10-11]。本研究以不同患者的血清标本作为对象，探讨了血浆miRNA-200b及miRNA-21在浆液性卵巢癌中的表达特点，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

研究时间为2013年8月到2017年12月，采用回顾性、总结研究方法，选择在我院接受手术切除的浆液性卵巢癌患者60例作为卵巢癌组，同时选取同期患有良性上皮性卵巢肿瘤患者50例作为良性组，选择具有正常卵巢组织的40例患者作为对照组。纳入标准：临床资料完整；所有患者术后均经病理结果证实；所有标本在采集后进行液氮保存；术前均未接受放、化疗及其他治疗；患者在自愿条件下签署了知情同意书；采集血清标本前都经过中医学伦理委员会批准。排除标准：临床资料缺项者；妊娠与哺乳期患者。

卵巢癌组患者年龄23～68岁，平均年龄(45.61±2.48)岁；平均病程(4.11±1.14)年；平均体重指数(21.48±2.77)kg/m2；临床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例；组织学分化程度：高分化30例，中分化20例，低分化10例。良性组患者年龄22～70岁，平均年龄(44.21±3.19)岁；平均病程(1.89±0.29)年；平均体重指数(22.43±3.19)kg/m2。对照组患者年龄21～72岁，平均年龄(44.90±4.82)岁；平均体重指数(23.14±2.82)kg/m2。

3组年龄、体重指数对比差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 血浆miRNA-200b及miRNA-21检测

取所有患者的全血样本，低温3 000 rpm/min离心10 min取血浆，每200 μl血浆样本加入900 μl MZA裂解液，混匀到完全匀浆。室温放置5 min后加入200 μl氯仿，剧烈振荡15 s，低温12 000 rpm/min 离心15 min；取水相，加入3倍体积的无水乙醇然后转入吸附柱，12 000 rpm/min离心30 s；取吸附柱，加入700 μl去蛋白液MRD，12 000 rpm/min离心30 s；取吸附柱，加入漂洗液500 μl，2 000 rpm/min离心30 s；重复洗涤1次；取吸附柱，加入洗脱缓冲液50 μl,12 000 rpm/min离心30 s，取提取产物。提取的RNA的浓度测定及质量鉴定，确保A260/A280>1.9。RNA样本经过加尾及反转录后进行定量real-time PCR，配成25 μl反应体系，反应条件为：94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环，实验结果采用荧光定量PCR中的相对定量法进行分析，每个标本设3个平行管，重复3次。miRNA-200b正向引物：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；miRNA-21正向引物：5'-CGCGGCAAAGTCCGAGGTTAT-3'，反向引物：5'-CGCGGAAACGTTACCATTA-3'。

1.3 统计方法

本研究的计量数据与计数数据采用SPSS 19.00软件进行分析，采用均数±标准差、率等表示，行t或卡方检验，3组之间对比为Kruskall-Wallis检验，相关性分析采用线性相关分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 miRNA-21表达量对比

卵巢癌组中血浆miR-21相对表达量显著高于良性组与对照组(P<0.05)，miR-21在良性组与对照组中的相对表达量对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别例数ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌组6010.44±0.53∗#-2.19±0.45∗#4.85±1.24∗#良性组5012.49±0.41-0.13±0.081.14±0.28对照组4012.63±0.43-0.09±0.021.09±0.14

注：#为与良性组对比，P<0.05；*为与对照组对比，P<0.05。

2.2 miRNA-200b表达量对比

卵巢癌组中血浆miRNA-200b相对表达量显著高于良性组与对照组(P<0.05)，miRNA-200b在良性组与对照组中的相对表达量(2-ΔΔCt)对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别例数ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌组6011.02±0.53∗#-3.22±0.46∗#5.58±1.33∗#良性组5014.20±1.22-0.22±0.091.32±0.43对照组4013.22±1.44-0.21±0.031.21±0.14

注：#为与良性组对比，P<0.05；*为与对照组对比，P<0.05。

2.3 miRNA-200b及miRNA-21表达与卵巢癌临床特征的相关性

不同临床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表达量对比,差异都有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miRNA-200b及miRNA-21表达与卵巢癌临床特征的相关性

注：*为与Ⅰ期或高分化对比，P<0.05；#为与Ⅱ期或中分化对比，P<0.05。

2.4 相关性分析

在卵巢癌患者中，线性相关分析显示血浆miRNA-200b与miRNA-21表达量呈现显著正相关(γ=0.562,P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌在我国发病率高，卵巢组织成分复杂，浆液性卵巢癌是比较常见的卵巢癌类型，约占原发性卵巢肿瘤的1/3[12]，其早期临床症状隐匿，多数者无明显临床症状，在确诊时多为晚期，因此患者预后生存率低，为此早期诊断卵巢癌是提高患者远期生存率的有效途径[13-14]。

miRNAs在多种肿瘤中均有表达，并在肿瘤发生与发展中发挥重要的生物学作用。不同组织学类型的卵巢癌的miRNAs谱不同，浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌，透明细胞癌的Ⅰ期卵巢癌miRNA的表达，透明细胞癌以高表达miR-30a-3p为特征，黏液性癌表现为高表达miR-192[15]。miRNAs在卵巢肿瘤组织与正常组织间的表达差异具有一定的普遍性，当前研究表明miRNA-200家族在浆液性卵巢癌的发病机制中起着类似癌基因的作用，可用于浆液性卵巢癌的早期诊断[16]。miRNA-200家族中miRNA-200b的过度表达显著促进了浆液性卵巢癌细胞的转移，并且它的高表达预示浆液性卵巢癌的不良预后。miRNA-21在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等多种标本以及细胞系都有检测出其水平异常升高，其能通过调节肿瘤抑制基因或转移抑制基因的功能，从而发挥促癌作用[17]。本研究显示卵巢癌组中血浆miR-21、miRNA-200b相对表达量显著高于良性组与对照组(P<0.05)，miR-21、miRNA-200b在良性组与对照组中的相对表达量对比差异无统计学意义(P>0.05)。当前也有研究表明miR-21及miR-200家族的低表达能促进卵巢肿瘤细胞的上皮细胞向间质细胞转化，从而提高细胞的转移和侵袭能力[18]。miRNA-200b的表达升高与卵巢癌的化疗耐药性有直接关系，miRNA-200b能够抑制具有促进上皮细胞转化过程的基因表达。

miRNAs与癌症的发生密切相关，较多的癌基因、抑癌基因以及和细胞增殖、侵袭、转移、血管形成等有关的基因均不同程度地受miRNA的调控，但目前有关卵巢组织miRNAs的研究相对较少。在卵巢肿瘤中，一些miRNA表达升高和一些miRNA低表达。有学者研究了卵巢上皮性肿瘤患者的miRNAs表达情况，发现表达上调倍数最高的包括miR-200b、miR-141，下调倍数最高的有miR-199a、miR-140等[19]。本研究显示不同临床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表达量对比差异都有统计学意义(P<0.05)。有研究显示miRNA-200b定位1号染色体，与浆液性卵巢癌的复发和总生存期显著相关[20]。还有研究发现上皮性卵巢癌组织的miR-21的相对表达量明显高于良性肿瘤及正常对照组，miR-21参与了肿瘤细胞的侵袭、血管浸润和转移的过程[21]。

miRNA在真核生物中可通过与靶mRNAs分子中3'-非翻译区结合后，使mRANs结构改变，从而调节机体细胞的分化、增殖、凋亡等一系列生理与病理过程。miR-21参与调节多种恶性肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移等过程，miR-21通过参与卵巢癌间质成纤维细胞的转化影响卵巢癌的发生、发展[22]。本研究直线相关分析显示卵巢癌血浆miRNA-200b与miRNA-21表达量成正相关性(P<0.05)。不过同一种miRNA在不同肿瘤中表达是不同的，可能由于一种miRNAs调控多种靶基因，miRNAs的表达又是受多基因调控的结果，且靶基因的功能又是多种多样的，所以miRNAs可表现出组织特异性[23]。

总之，血浆miRNA-200b与miRNA-21在卵巢癌中呈现高表达状况，与卵巢癌的临床分期与组织学分化程度显著相关，两者可相互影响，在卵巢癌的发生、发展中发挥癌基因的功能。