8种常用农药对赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）的急性毒性效应*

盛雨璐，鲍 静，王鸿侠，刘静怡，施时迪

（台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000）

目前，我国土壤污染的总体形势严峻，由土壤污染引发的农产品质量安全问题和群体性事件逐年增多［1］。农药的广泛使用在为农业发展和人类粮食供给做出巨大贡献的同时，也对土壤造成了不同程度的污染，是社会与公众关注的热点问题［2］。土壤动物是土壤生态系统中的重要成分，在土壤生态系统平衡维持中起重要作用。蚯蚓是重要的土壤动物，约占土壤生物量的60%-80%，其生存活动可促进有机质的分解、土壤养分的循环与释放、改善土壤结构和土壤的理化性状，在维持土壤生态系统功能中起着不可替代的作用［3］。由于赤子爱胜蚓对毒物敏感、体型较大，且具有标准的急毒性和亚急毒性测定方法，常被作为生态毒理实验的标准物种［4］。因此，国内外不少学者将赤子爱胜蚓作为土壤污染状况的重要指示生物进行研究［5］，并通过对蚯蚓的生态毒理学研究反映所测污染物的毒性效应及土壤的污染状况［6］。

以赤子爱胜蚓为研究对象，探索唑醚·代森联、2-甲-4-氯钠、噁霉灵、苯醚甲环唑、福美双、烯酰吗啉、农用硫酸链霉素和灭蝇胺等8种常用农药对蚯蚓的急性毒性效应；旨在明确这些农药对蚯蚓毒性的剂量-效应关系，及其在环境中的安全浓度（safe concentration,SC）。研究结果不仅为农药残留对环境的影响提供科学依据，也可为整个土壤动物区系安全阈值的确定提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试生物

实验所用赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）由江苏省句容市王军蚯蚓养殖场提供。实验选择体重为400 mg～500 mg，环带明显且大小较为一致的健康成蚓进行实验。

1.1.2 受试农药

唑醚·代森联72%唑醚·代森联为代森联（含量66%）和吡唑醚菌酯（含量6%）混配而成的杀菌剂，属于水分散粒剂，由陕西汤普森生物科技有限公司生产。

苯醚甲环唑苯醚甲环唑是有效成分为60%的杀菌剂，属于水分散粒剂，由海利尔药业集团股份有限公司生产。

烯酰吗啉烯酰吗啉是有效成分为80%的杀菌剂，属于水分散粒剂，由江苏辉丰生物农业股份有限公司生产。

霉灵是有效成分为70%的杀菌剂，属于可湿性粉剂，由天津市绿亨化工有限公司生产。

2-甲-4-氯钠2-甲-4-氯钠是有效成分为56%的除草剂，属于可溶性粉剂，由安徽华星化工有限公司生产。

福美双福美双是有效成分为80%的杀菌剂，属于水分散粒剂，由比利时特胺有限公司生产。

灭蝇胺灭蝇胺是有效成分为50%的杀虫剂，属于可湿性粉剂，由浙江乐吉化工股份有限公司生产

农用硫酸链霉素农用硫酸链霉素是有效成分为72%的杀菌剂，属于可溶性粉剂，由重庆丰化科技有限公司生产。

1.1.3 受试农药质量浓度设计

正式实验前进行预实验，根据预实验得出的最小致死浓度和最大存活浓度，按照等差法设计质量浓度梯度序列进行正式实验，8种农药的浓度梯度设计见表1。

表1 受试农药的实验浓度（μg试农药-2）Table 1 The concentrations of tested pesticides（μg·cm-2）

1.2 实验方法

1.2.1 标准滤纸法

标准滤纸法参照经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）207的方法［7］，并在此基础上加以改进。向底部铺有一层滤纸的培养皿（直径150 mm×高25 mm）中加入5 mL蒸馏水。将赤子爱胜蚓洗净放在滤纸上，用塑料薄膜封口，并用解剖针将塑料薄膜扎孔，将培养皿放入温度为（20±1）℃，湿度为80%～85%的恒温培养箱中清肠24 h。

在直径150 mm的培养皿中垫入直径为150 mm的一层滤纸。将清肠后的赤子爱胜蚓清洗干净，用滤纸吸去多余水分，每个培养皿放10条赤子爱胜蚓，并用塑料薄膜封口，用解剖针在塑料薄膜上扎孔，然后将其置于（20±1）℃，湿度为80%～85%的恒温培养箱中培养。每个浓度设3个重复，同时设空白对照组，定期观察。在24 h、48 h分别观察记录死亡数，以前尾部对机械刺激无反应视为死亡。

1.2.2 数据处理

实验所得数据采用统计软件IBM SPSS Statistics22中的概率单位法（Probit）。分析得到农药对蚯蚓的急性毒性线性回归方程、半数致死浓度（Lethal Concentration 50，LC50）和95%置信区间。并依据特伦堡（Turubell）的安全浓度计算公式：48 h LC50×0.3/（24 h LC50/48 h LC50）2得出安全浓度（Safe concentration，SC）［8］。

2 结果与分析

2.1 2-甲-4-氯钠对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的2-甲-4-氯钠处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为 50.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，而质量浓度为 150.0 μg·cm-2，其死亡率超过 50%；48 h 观察时，当质量浓度为 50.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率为 10%，而质量浓度为 250.0 μg·cm-2，其死亡率达到100%。且2-甲-4-氯钠对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

表2 8种常见农药处理赤子爱胜蚓的死亡率Table 2 The death rates of the Eisenia foetida treated with eight commonly used pesticides,respectively

2-甲-4-氯钠对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出2-甲-4-氯钠对赤子爱胜蚓的24 h和48 h LC50数值分别为149.6 μg·cm-2和128.5 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 28.4 μg·cm-2。

2.2 农用硫酸链毒素对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的农用硫酸链毒素处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24h观察时，当质量浓度为 500.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，质量浓度为 800.0 μg·cm-2，其死亡率达到 30%；48 h 观察时，当质量浓度为600.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率超过50%。且农用硫酸链毒素对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

农用硫酸链毒素对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出农用硫酸链毒素对赤子爱胜蚓的24 h和48 h LC50数值分别为 882.3 μg·cm-2和595.7 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 81.5 μg·cm-2。

表3 8种常见农药对赤子爱胜蚓的24 h急性毒性效应的回归分析Table 3 The regression analysis of the acute toxic effects of eight commonly used pesticides on Eisenia foetida within 24 h

2.3 福美双对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的福美双处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为300.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，质量浓度为 600.0 μg·cm-2，其死亡率依旧小于 50%；48 h 观察时，当质量浓度为 200.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率为 23.3%，而质量浓度为 400.0 μg·cm-2，其死亡率超过50%。且福美双对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

福美双对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出福美双对赤子爱胜蚓的 24 h 和 48 h LC50数值分别为 723.5 μg·cm-2和 353.3 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 25.3 μg·cm-2。

2.4 灭蝇胺对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的灭蝇胺处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为600.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，质量浓度为 900.0 μg·cm-2，其死亡率依旧小于 50%；48 h 观察时，当质量浓度为 700.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率超过 50%，而质量浓度为 900.0 μg·cm-2，其死亡率达到96.7%。且灭蝇胺对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

表4 8种常见农药对赤子爱胜蚓的48 h急性毒性效应的回归分析Table 4 The regression analysis of the acute toxic effects of eight commonly used pesticides on Eisenia foetida within 48 h

灭蝇胺对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间呈现显著的线性正相关关系（P＜0.05），而在48 h内赤子爱胜蚓的农药浓度与死亡率之间呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出灭蝇胺对赤子爱胜蚓的 24 h 和 48 h LC50数值分别为 1015.4 μg·cm-2和 657.8 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 82.8 μg·cm-2。

2.5 唑醚·代森联对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的唑醚·代森联处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为 33.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，而质量浓度为 66.0 μg·cm-2，其死亡率接近 50%；48 h 观察时，当质量浓度为 33.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率为 16.7%，而质量浓度为 66.0 μg·cm-2，其死亡率达到53.3%。且唑醚·代森联对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

唑醚·代森联对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出唑醚·代森联对赤子爱胜蚓的 24 h 和 48 h LC50数值分别为 64.1 μg·cm-2和 59.9 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 15.7 μg·cm-2。

2.6 苯醚甲环唑对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的苯醚甲环唑处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为 100.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，质量浓度为 300.0 μg·cm-2，其死亡率为 23.3%；48 h 观察时，当质量浓度为 250.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率超过 50%，而质量浓度为 300.0 μg·cm-2，其死亡率为80%。且苯醚甲环唑对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

苯醚甲环唑对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，由表3、表4可知，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出苯醚甲环唑对赤子爱胜蚓的 24 h 和 48 h LC50 数值分别为 382.7 μg·cm-2和 222.4 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 22.5 μg·cm-2。

2.7 噁霉灵对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的噁霉灵处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，由表2可知，24 h观察时，当质量浓度为100.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓没有出现死亡，而质量浓度为 190.0 μg·cm-2，其死亡率超过 50%；48 h 观察时，当质量浓度为 100.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率为 6.7%，而质量浓度为 220.0 μg·cm-2，其死亡率达到100%。且噁霉灵对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

噁霉灵对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出噁霉灵对赤子爱胜蚓的24h和48hLC50数值分别为185.7 μg·cm-2和148.0μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为28.2μg·cm-2。

2.8 烯酰吗啉对赤子爱胜蚓的急性毒性效应

不同浓度的烯酰吗啉处理赤子爱胜蚓的累计死亡率见表2，24 h观察时，当质量浓度为100.0 μg·cm-2，其死亡率达到3.3%，而质量浓度为700.0 μg·cm-2，其死亡率依旧小于50%；48 h观察时，当质量浓度为 100.0 μg·cm-2，赤子爱胜蚓的死亡率为 6.7%，而质量浓度为 700.0 μg·cm-2，其死亡率达到 96.7%。且烯酰吗啉对赤子爱胜蚓的平均死亡率随着农药浓度的升高和暴露时间的延长而增加，因此该农药对蚯蚓的毒性存在明显的剂量-效应关系。

烯酰吗啉对赤子爱胜蚓的24 h和48 h急性毒性效应的回归分析见表3、表4，通过回归分析，在24 h和48 h内农药浓度与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性正相关关系（P＜0.01）。得出烯酰吗啉对赤子爱胜蚓的24 h和48 h LC50数值分别为808.7 μg·cm-2和452.2 μg·cm-2。通过计算可知其安全浓度（SC）为 42.4 μg·cm-2。

3 讨论

快速地判断农药对环境的生态毒性的测定方法，常用赤子爱胜蚓开展急性毒性试验，以探明农药在短时间接触蚯蚓后所所产生的致死效应。因此，急性毒性试验在农药的生态毒理学研究中具有比较重要的作用［9-10］。有关蚯蚓的急性毒性试验方法，国内外常用标准滤纸法、注射法、自然土壤法、人工土壤法、饲喂法、浸入法、强迫摄食法和点滴法等［11-13］。但由于标准滤纸法重复性较好、简单和快速，能够较好地反映农药的固有毒性和对土壤生态系统的潜在毒性，从而更好地研究农药对环境的影响［14］。

本次实验通过标准滤纸法来探究赤子爱胜蚓急性毒性效应也存在一定的不足，比如实验过程中，由于农药粘附于滤纸表面，蚯蚓体表直接与药剂接触，吸收量大、吸收速率快，这使得实验当中所得到的毒性效应比真实土壤中相对较高。8种农药对赤子爱胜蚓均具有一定的急性毒性效应，其毒性大小序列为唑醚·代森联＞2-甲-4-氯钠＞噁霉灵＞苯醚甲环唑＞福美双＞烯酰吗啉＞农用硫酸链霉素＞灭蝇胺。容易发现各农药间毒性差异较大，原因可能是因为农药的作用机制、化学结构和生物可利用性不同，从而导致蚯蚓吸收机制不同，因此标准滤纸法测定的毒理数据在制定土壤生态筛选基准上的作用是有限的。

目前针对农药的亚致死效应如对蚯蚓的行为、生长、繁殖和组织结构等的影响，以及更接近于实际生态系统中的低剂量农药对蚯蚓的长期毒性效应等方面的研究较少。因此，应加强农药对蚯蚓的亚致死效应和分子毒理学研究，为全面评价农药对环境的生态风险提供基础数据。