环状RNA与骨科相关疾病研究进展

陈德龙 陈鹏 王粤淇 王海彬

1．广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405

2．广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510405

非编码 RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子，近20年来，具有调控作用的非编码RNA分子被发现及其功能研究，大大改变了人们对RNA分子的认知，也极大深化了人们对基因表达调控的理解。其中，环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类通常由一个以上外显子构成的环形RNA分子，概念最初是由Sanger等［1］于1976年提出的，他发现某些高等植物的类病毒是单链、共价闭合的环状 RNA分子。然后在1979年通过使用电子显微镜验证了环状RNA存在于几个真核细胞中［2］。1986年，在感染丁型肝炎病毒后，人类首次观察到circRNA［3］。在真核生物中，规范剪接由剪接体去除内含子并将外显子连接成线性 RNA转录产物。20多年前，Nigro等［4］发现circRNA时，人们认为它是错误剪接生成的副产品或逃逸内含子套索的中间产物。自2012年以来，随着生物信息学和高通量测序的快速发展和广泛应用，这种观点发生了巨大变化［5］。最近的许多报道证明了circRNA在病理生理学中的重要性，这些circRNA可以作为 miRNA海绵发挥作用［6-7］，调节转录和基因表达［8-9］，有些甚至翻译成蛋白质［10-11］。circRNA参与各种疾病的发病机制，具有序列高度保守、结构稳定、丰度高、有一定的组织特异性和疾病特异性［12］，使它们成为生物学领域的热点。circRNA作为疾病诊断、预后生物标志物和治疗靶标也具有潜在的价值［13］。本文简要描述了circRNA的特征、生物起源、分类和功能，并且强调了circRNA与多种骨科疾病之间的关系。

1 circRNA的特征

circRNA广泛存在于真核细胞中，通常由1～5个外显子产生［14］，主要位于细胞质中［5］，少部分含有内含子的circRNA起源于细胞核［9］。circRNA的长度在几百到几千个核苷酸之间［15］，平均547个核苷酸［14］，大多数circRNA的半衰期超过48 h。重要的是，circRNA来自非规范的可变剪接，其将剪接供体连接至上游剪接受体并形成共价闭合环，没有5’帽子或3’多聚A尾，并通过共价键环化。这些特征赋予circRNA对核酸外切酶RNase R的抗性，在组织和血浆中更稳定。而且circRNA在细胞、组织中广泛表达［16-17］，具有成为生物标志物和治疗靶标的潜力。

2 circRNA的分类

circRNA的生成与可变剪接相关，而可变剪接是真核基因表达中必不可少的步骤，它受到剪接体和核糖酶的调控。circRNA由外显子、内含子、基因间区域、以及 5’或 3’非翻译片段产生［9，18］。circRNAs主要分为3类:外显子环状 RNA(exonic circular RNAs，ecircRNAs)、内 含 子 环 状 RNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外显子-内含子环状 RNA(exon-intron circular RNAs，EIciRNAs)。

3 circRNA的生物起源

3.1 ecircRNA的生物起源

大多数ecircRNA来自外显子，关于ecircRNA生物合成已经提出了3个主要模型:(1)套索驱动环化(也称为外显子跳跃)。它是位于5’端的外显子受体和位于3’端外显子供体两者共价结合后形成含外显子的套索中间体，然后去除套索中的内含子以产生ecircRNA［12］。(2)内含子配对驱动环化(也称为直接反向剪接)。通过侧翼内含子的直接碱基配对形成环状结构，然后切除环内反向剪接的内含子，从而产生ecircRNA［12］。(3)重新剪接驱动环化。在通过经典前mRNA剪接合成成熟mRNA后，发生反向剪接和环化，导致ecircRNA形成［19］。一些RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)在此过程中充当调节因子，例如muscleblind(MBL)剪接因子可以将侧翼内含子生成的circMbl前体环化成circMbl，并且circRNA的生成受到MBL表达水平的调控［20］。RBP与前mRNA的侧翼内含子内的特定序列结合，可以通过稳定剪接或抑制线性RNA来调节circRNA形成。

3.2 其他类型circRNA的生物起源

EIciRNA的生物合成与ecircRNA过程类似，唯一的区别在于内含子是完全剪接(ecircRNA)或部分剪接(EIciRNA)。与外显子circRNA形成不同，ciRNA的产生主要取决于内含子两端的共有基序，即5’剪接位点附近存在一段7nt左右富含GU碱基的结构，分支点附近存在一段11nt左右富含C碱基的结构。因此，ciRNA不是以3’-5’磷脂结合，而是以 2’-5’磷脂连接［9］。

4 circRNA生物学功能

4.1 调节线性RNA转录

circRNA影响剪接过程，是选择性剪接和转录的关键调节因子。它们不仅可以增强线性RNA的转录，而且还能抑制它们的转录。外显子circRNAs是主要种类，在合成过程中与规范剪接互相竞争(见图1)。一方面，规范剪接修饰前mRNA，形成线性RNA，外显子对这一过程必不可少;另一方面，当circRNA和线性RNA的形成需要共同的外显子时，需要相互竞争。此外，这两个过程可能共享相同的位置［21］。对于由内含子(如ciRNA和EIciRNA)形成的circRNA，一些研究揭示了这些circRNAs能调节亲本基因的表达。已经证明的ciRNA或EIciRNA，例如c-sirt7可以与聚合酶II复合物相互作用，相应基因锚蛋白重复结构域52(ankyrin repeat domain 52，ANKRD52)和去乙酰化酶 7(sirtuin 7，SIRT7)的表达水平下降［22］。如上所述，在circRNA形成期间，调节其亲本基因的表达，这是circRNA在其他功能中发挥作用的先决条件之一。

4.2 miRNA海绵

miRNA作为在转录后水平基因表达的关键调控因子，它可以根据碱基互补配对原则结合到互补的mRNA位点上［23-24］，miRNA的改变会调控mRNA和蛋白质的表达。circRNA是一种拥有miRNA反应原件(microRNA response element，MREs)的竞争性内源性 RNA分子，具有 miRNA海绵作用。ceRNA的缺失和出现会通过影响miRNA功能活性从而调节基因表达。具有互补序列的circRNA可以与其靶miRNA结合，从而抑制这些miRNA的功能［25］。然而，海绵作用是否是circRNA的普遍功能仍在讨论中。

图1 CircRNA生物学功能示意图(自拟)Fig．1 Biological function of circRNA

CiRS-7也称为CDR1as，已经被证明可以作为miRNA海绵的典型例子［26-27］。具有超过70个常规miR-7结合位点的CiRS-7由CDR1as基因的反义转录物形成［26］。此外，CIR-7不能被miRNA-7介导的RNA诱导沉默复合物体(RNA-induced silencing complex，RISC)降解［28］。miR-7 是众多信号通路中的关键参与者之一，ciRS-7-miR-7轴广泛表达于各种癌症，如非小细胞肺癌和结肠癌［29-30］。

4.3 蛋白质海绵

circRNA还可以作为RNA结合蛋白的海绵来调节蛋白质水平。RBP可参与许多生物活性，例如细胞增殖、分化，细胞凋亡、衰老，细胞对氧化应激的反应等。据报道，circRNA可以结合多个RBPs，例如 RNA 聚合酶 II(RNA polymerase II，Pol II)、Argonaute(AGO)蛋白、MBL、RNA结合蛋白Quaking(QKI)等，通过相互作用形成RNA-蛋白质复合物。这种与RBPs的相互作用类似与miRNA海绵，导致RBPs的消耗和减少与RNA靶标的互相作用。在苍蝇和人类中发现的circMBL可以在多个结合位点结合MBL蛋白［25］。另外，CDR1As可以连接和切割miRNA AGO蛋白，抑制其翻译并促进其降解［18］。

4.4 与蛋白质相互作用

circRNA可以与蛋白质相互作用以影响细胞行为。例如circ-FOXO3通过与细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和 CDK 抑制剂P21结合，阻碍CDK2使细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E磷酸化，从而抑制细胞周期［31］。

4.5 蛋白质翻译

circRNA可能不是真正的一类ncRNA，因为其中有一些circRNA可以翻译蛋白质。早在1995年，研究人员发现当circRNA含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)元件时，真核生物核糖体能启动翻译［32］。当将IRES插入含有裂解GFP的小基因中时，得到的circRNA能产生大量的GFP蛋白［33］。尽管已经进行了一些研究，但是circRNA的翻译细节仍然未知，仍需进一步探索。

5 circRNA在骨科方面的运用

5.1 骨细胞

转录因子BMP2属于转化生长因子β超家族，是重要的人类细胞因子之一。它能诱导骨和软骨形成，并在胚胎生长、细胞生长和分化、骨发育和骨折修复中发挥重要作用。用BMP2处理的MC3T3-E1细胞共有158个差异表达的circRNA，其中74个上调，84个下调。在 BMP2处理后，PCR验证 hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和 hsa_circ_0010042的表达显着增加。hsa_circ_0005846和hsa_circ_0 019 142分别与51和21个miRNA相互作用，并且都海绵样作用于 miR-7067-5p，参与 FGF、EGF、PDGF 和Wnt信号通路，调节细胞生长和分化［34］。

在小鼠破骨细胞发育的不同阶段存在共同表达的circRNA。circRNA-miRNA协同作用在破骨细胞形成中起重要作用。对于破骨细胞前期，147个circRNA和119个miRNA上调，109个circRNA和941个miRNA下调。对于成熟的破骨细胞，78个circRNA和38个miRNA上调，135个circRNA和24个miRNA下调。对于活化的破骨细胞，111个circRNA和94个miRNA上调，45个circRNA和975个miRNA下调。在OC发生过程中的所有阶段，19个circRNAs和22个miRNAs都上调，5个circRNAs和 15miRNAs都下调［35］。

骨髓间充质干细胞是多能干细胞，广泛运用于组织工程研究，骨髓间充质干细胞向成骨方向分化是骨再生的希望。Zhang等［36］利用RNA-seq技术探究骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中明显异常表达的circRNAs和miRNAs，在第0天和第7天的比较中发现差异表达的共有3 938个上调的circRNAs，1 505个下调的circRNAs和42个上调的miRNAs，18个下调的miRNAs。通过ALP染色和茜素红染色证实沉默circIGSF11促进骨髓间充质干细胞向成骨分化并增强miR-199b-5p的表达。

5.2 骨性关节炎

人骨性关节炎(osteoarthritis，OA)软骨中存在许多异常表达的circRNA，这些circRNA可能参与了OA的发病机制。在一项研究中，Liu等［37］发现与正常软骨相比，总共有71个circRNA在OA软骨中差异表达，其中有16个上调，55个下调。其中OA中circRNA-CER的表达是正常组的2.5倍。白介素1(Interleukin-1，IL-1)和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是 OA 关键的炎性介质，在IL-1和TNFα刺激软骨细胞下，CircRNA-CER靶向miR-136调节基质金属蛋白酶 3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、软骨Ⅱ型胶原蛋白(collagen type II，COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表达降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。另一项研究中，在骨关节炎病人中，受损的软骨相比完整的软骨共有104个circRNAs差异表达，其中44个上调，60个下调。软骨细胞在应力刺激下，circRNA-MSR表达增加，并可抑制TNF-α的表达并增加ECM的形成，增加COL2和Aggrecan的表达量［38］。

炎症是OA软骨病理学的重要驱动因素。eNAMPT也被称为visfatin，在人类OA软骨细胞中抑制蛋白多糖的合成并增加基质降解酶的表达。has-circ-0005105不仅可以促进NAMPT的表达，而且可以促进前列腺素E2、IL-6和IL-8的产生。细胞凋亡诱导软骨细胞数量减少在OA软骨组织的退化中起重要作用［39］。Li等［40］报道 has_circ_0045714可通过miR-193b靶基因IGF1R促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡。

5.3 骨肉瘤

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)已成为儿童及青少年时期死亡率最高的癌症，具有局部侵蚀性和易于全身转移的特征。Caspase-1是一种半胱氨酸蛋白酶，已被证明能够蛋白水解并激活IL-1β和IL-18等炎性细胞因子，从而导致形成炎性微环境，在骨肉瘤组织中呈高表达。circ-0016347海绵样作用于miR-214，上调具有致癌潜力半胱天蛋白酶-1(caspase-1)的表达，促进骨肉瘤的增殖和侵袭［41］。在骨肉瘤患者中，circHIPK3的表达与 Enneking分期(P=0.042)和肺转移(P=0.036)显著相关。ROC曲线下面积为0.783，灵敏度和特异度分别为0.56和0.84。Kaplan-Maier分析还显示circHIPK3的低表达与OS患者的总体存活时间和预后较差相关。此外，功能分析表明circHIPK3过表达显著抑制体外OS细胞增殖、迁移和侵袭［42］。在另外一项研究中，circUBAP2可以作为miR-143的海绵发挥作用并抑制miR-143的表达，从而上调骨肉瘤中抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制骨肉瘤细胞的凋亡［43］。总之，circRNA在骨肉瘤诊断和预后方面具有重要价值，未来的工作中需要更多的样本来进一步确定circRNA的作用。

6 总结

随着高通量测序技术和生物信息学的进步，对circRNA的研究越来越受到关注。circRNA形成的机制是多种多样的，产生不同类型的circRNA具有不同的功能，例如调节线性RNA转录、miRNA和蛋白质海绵、翻译蛋白质等。这些复杂的功能使circRNA能够通过各种信号通路参与许多疾病的发生和发展，特别是对于骨科疾病，为骨科疾病的发病机制提供了新的见解。circRNA结构稳定、丰度高、有一定的组织特异性和疾病特异性，可能成为临床诊断生物标志物和治疗靶点，但目前均是体外研究，结果需要在体内验证。因此，为了充分了解circRNA在骨科疾病发展中的分子机制，必须进行更广泛的研究。