葛根素通过NF-кB信号通路调节破骨细胞的分化

于冬冬 赵丹阳 姚啸生 杨鸫祥 侯德才

1．辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032

2．沈阳市第一人民医院神经内科，辽宁 沈阳110041

绝经后骨质疏松症(postmenopasal osteoporosis，PMOP)是最常见的原发性骨质疏松症。PMOP导致骨质疏松性骨折的风险增加［1］，是老年女性骨折的主要原因之一［2］。成骨细胞和破骨细胞的动态平衡是维持骨稳态的重要条件，在PMOP的发病过程中破骨细胞过度活化，同时伴随着过度的骨吸收［3］。因此，抑制破骨细胞活性及分化仍然是目前PMOP防治的重要手段及方法。

葛根素作为葛根的活性成分，作用于机体发挥不同的药理学作用，如抗氧化、抗应激、抗感染、抗肿瘤等。笔者前期研究发现葛根素能够抑制成骨细胞的凋亡，继而达到防治骨质疏松症的药理学作用［4］。有研究发现葛根素能够防治卵巢切除(OVX)大鼠的骨质疏松、调节破骨细胞的形成，但是具体的潜在机制还不清楚［5］。

本实验的目的是研究葛根素对破骨细胞形成及分化的影响，探索其潜在的作用机制，为葛根素防治PMOP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞(ATCC，美国)。

1.1.2 试剂:葛根素(Puerarin，PUE缩写，南京狄尔格医药科技公司。溶于 DMSO，储存浓度10－5mol/L，－ 20 ℃ 保存);sRANKL(Peprotech，美国);M-CSF(Peprotech，美国);DMEM(Hychone，美国);进口胎牛血清(Hychone，美国);TRAP染色试剂盒(Sigma，美国);Osteoassay surface Mltiple well plate(Corning，美国);NF-кB免疫荧光检测试剂盒(Beyotime，上海)。

1.1.3 仪器:细胞孵箱(Thermo，美国);倒置相差显微镜(Olympus，日本);免疫荧光显微镜(Olympus，日本);AMR-100酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7培养及诱导分化:小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7培养传代，未分化培养基含(DMEM、10%胎牛血清、不含抗生素，37℃，5%CO2)。细胞接种于6孔板内，细胞密度:1×104细胞/孔，24 h后换成诱导分化培养液培含(DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL RANKL、15 ng/mLl M-CSF)继续培养7 d。

1.2.2 WST-1检测细胞增殖活性:分组:对照组、10－6～10－10mol/L 的 PUE 组。细胞平铺(5×103细胞/孔)96孔平板中，24 h后更换分化培养基，诱导分化培养7 d 后，细胞经 PUE 处理3、12、24、48、72 h后，每孔加 20 μL WST－1 检测液。在 37°C、5%CO2的细胞培养箱中孵育1 h。490 nm读取吸光度值。OD值=(处理后细胞OD值－对照组细胞OD值)/N，n＞3。

1.2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化:分组:A组(对照组)，B组(sRANKL+M-SCF组)，C组(PUE+sRANKL+M-SCF组)。RAW264.7细胞(5×104细胞/孔)在 24孔板内培养，在含和不含 PUE(10－8mol/L)的条件下加入诱导分化培养液诱导分化7 d。细胞TRAP染色根据Sigma染色试剂盒进行操作。

1.2.4 Osteoassay surface Mltiple well plate检测破骨细胞吸收活性:分组:A组(对照组)，B组(sRANKL+M-SCF组)，C组(PUE+sRANKL+MSCF组)。RAW264.7细胞(5×104细胞/孔)在Osteoassay surface Mltiple well plate板内培养(24孔)，在含和不含PUE(10－8mol/L)的条件下加入诱导分化培养液诱导分化7 d。在培养结束时进行显微镜拍照，使用Image J软件测量吸收面积。

1.2.5 免疫荧光检测 NF-кB核转位:分组:A组(对照组)，B组(sRANKL+M-SCF组)，C组(PUE+sRANKL+M-SCF组)。细胞在盖玻片上并培养过夜，在含和不含PUE(10－8mol/L)的条件下加入诱导分化培养液诱导分化7 d。免疫固定液将细胞固定(室温15 min)，用免疫洗涤液(含0.1%的Triton X-100)洗涤。用p-p65抗体孵育细胞(以1∶400的比例稀释)过夜，用DAPI(5 min)染色细胞核，免疫荧光显微镜观察细胞。

1.2.6 Western blot检测:细胞分 sRANKL+MSCF、PUE+sRANKL+M-SCF组。细胞加入裂解液提取蛋白、定量、上样、电泳、转膜、封闭、一抗过夜、二抗孵育、ECL发光法曝光成像，扫描入电脑，n＞3。Image J软件测定平均灰度值。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，采用ANOVA方法，数据以均数±标准差(珋x±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素抑制破骨细胞增殖活性

WST－1法检测PUE对破骨细胞增殖活性的影响(图1)。结果显示，各个浓度的PUE均能抑制破骨细胞的增殖活性(其中PUE 10－8mol/L，预处理3 h，与对照组比较，P＜0.05，n＞3)，PUE(10－8mol/L)作用3 h后具有较大的增殖活性抑制作用。因此，PUE(10－8mol/L)预处理3 h作为实验用药浓度及作用时间。

2.2 破骨细胞的形态学观察

倒置相差显微镜观察细胞形态(图2)，未诱导分化的RAW264.7细胞呈圆形，透光度好，边界清晰，无触角或少量触角。加入诱导液后，细胞触角略增多，细胞略呈短梭形，细胞透光度下降，细胞融合成巨大的多核破骨细胞(破骨细胞的数量=细胞核≥3个细胞的数量/总的细胞数量，诱导分化组P＜0.01，与对照组比较，n＞3);加入 PUE后，破骨细胞的分化受到抑制(P＜0.05，与非PUE处理组比较，n＞3)。

图1 葛根素抑制破骨细胞增殖Fig．1 Puerarin inhibits osteoclast proliferation

图2 形态学观PUE抑制破骨细胞形成 A:对照组;B:诱导分化组(sRANKL+M-SCF诱导分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 预处理 3 h后，sRANKL+M-SCF诱导分化7 d)。Fig．2 Morphologicalobservation ofPUE inhibiting osteoclastformation．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group (sRANKL + M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化

TRAP检测PUE(10－8mol/L)对破骨细胞分化的影响(图3)，笔者前期研究发现浓度为15 ng/mL的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d具有明显的诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化的效果［5］。在诱导分化培养基中加入PUE(10－8mol/L)预处理3 h后，RAW264.7细胞诱导分化7 d，结果显示未加PUE组的破骨细胞分化明显(P＜0.01，与对照组比较，n＞3)，PUE能够明显抑制破骨细胞的分化(P＜0.05，与非PUE处理组比较，n＞3)。

图3 PUE抑制破骨细胞的分化 A:对照组;B:诱导分化组(sRANKL+M-SCF诱导分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L预处理 3 h后，sRANKL+MSCF诱导分化7 d)。Fig．3 PUE inhibits osteoclast differentiation．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

2.4 Osteo Assay Surface检测破骨细胞吸收活性

破骨细胞分化后，会吞噬Osteoassay plate的仿生物的骨组织，进而形成吸收池(absorb pit)，吸收池的大小与破骨细胞的吸收活性呈正相关。本研究结果显示(图4)，诱导分化组形成明显的吸收池，达到视野的30%以上(P＜0.01，与对照组比较，n＞3)，加入PUE后，吸收池缩小，提示破骨细胞的吸收活性受到抑制(P＜0.05，与非PUE处理组比较，n＞3)。

2.5 免疫荧光检测NF－кB核转位

NF-κB未被激活时被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活。本研究结果显示(图5)，破骨细胞分化后，p65向细胞核内转位，PUE能够抑制其向细胞核内转位。

2.6 Westerm blot结果检测

进一步分析PUE抑制成骨细胞分化的潜在机制(图6)，免疫印迹检测通路蛋白显示，sRANKL+M-CSF促进细胞核内p65的磷酸化，其中加入诱导液30 min时p65的磷酸化明显增多，而60 min时其磷酸化降低。加入PUE后第30 min，p65的磷酸化受到抑制，说明PUE发挥其抑制破骨细胞分化的药效学机制通过抑制NF-κB信号通路完成(P＜0.01，与PUE+sRANKL+M-CSF作用组比较，n＞3)。

图4 PUE抑制破骨细胞的吸收活性 A:对照组;B:诱导分化组(sRANKL+M-SCF诱导分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 预处理 3 h后，sRANKL+M-SCF诱导分化7 d)。Fig．4 PUE inhibits the absorptive activity of osteoclasts．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

3 讨论

PMOP导致骨质疏松性骨折的风险增加［6-7］。在PMOP的发病过程中，破骨细胞过度形成及分化，因此，抑制破骨细胞形成及分化仍然是PMOP治疗的重要策略［3］。

目前临床使用的抗PMOP的药物，长期使用都有一些局限性。例如，长期使用双膦酸盐治疗会引起相关的心房颤动、颌骨坏死和严重抑制骨转换［8］。此外，长期使用SRMS药物(雷洛昔芬)导致静脉血栓栓塞和致命中风已被报道［9］。因此，需要一种不仅可以提高骨密度、而且还可以促进新骨的形成、长期用药没有有严重副作用的新药。

图5 PUE抑制NF-κB核转位 A:对照组;B:诱导分化组(sRANKL+M-SCF诱导分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L预处理3 h后，sRANKL+M-SCF诱导分化7 d)。Fig．5 PUE inhibits nuclear translocation of NF－κB．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

图6 PUE抑制P65磷酸化Fig．6 PUE inhibits P65 phosphorylation

葛根素作为葛根的活性成分，抵抗机体各种疾病，如心血管系统疾病、脑部疾病、肿瘤、及炎症等。葛根素具有抗骨质疏松的药效学作用，能够预防去卵巢(OVX)大鼠的骨丢失，提高骨量，而且不增加雌激素样的作用。最近的研究报道，葛根素能够抑制破骨细胞形成，抑制骨丢失［4］，但潜在的还不清楚。

本研究发现，葛根素能够抑制破骨细胞的分化，加入葛根素后破骨细胞不仅数量减少。同时吸收池实验显示，加入葛根素后破骨细胞的吸收能力明显下降，说明破骨细胞的活性受到抑制，这对于防治PMOP来说，具有非常重要的意义。

NF-κB信号通路在调节破骨细胞的形成及分化中发挥重要作用［10］。本研究发现，葛根素抑制NF-κB的核心蛋白p65的磷酸化，抑制其从细胞浆向细胞核转位，进而防止破骨细胞形成。因此，葛根素通过NF-κB信号通路抑制破骨细胞的分化，进而达到防治PMOP的药理学作用。

目前研究骨质疏松症的发病机理虽然较多，但是基于NF-κB信号通路，从破骨细胞分化为研究的切入点，探索中医药活性成分葛根素对破骨细胞分化机制的相关研究较少。因此，本研究对于中医药临床防PMOP具有一定的意义。