银杏内酯B对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

银杏内酯是银杏叶的主要活性成分，其中以银杏内酯B活性最高，秦兵等[1-3]研究发现银杏内酯B通过抑制细胞凋亡进而对脑组织、肝脏缺血再灌注损伤起到一定抑制作用。本研究探讨银杏内酯B对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，体质量240～260 g，由河北省实验动物中心提供[SCXK(冀)2013-1-003]，合格证号：201704002。

1.2 实验药物与试剂 银杏内酯B购自美国Sigma公司(批号：33570)；末端标记法(TUNEL)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：161008)；凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3)多克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：201612013、201608010、201707009)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、模型制备与给药 采用随机数字表法将100只SD大鼠随机分为假手术组(0.9%氯化钠溶液)、模型组(0.9%氯化钠溶液)及银杏内酯B低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组20只。其中银杏内酯B中剂量(30 mg/kg)组根据人给药剂量换算而来，另设低剂量组(15 mg/kg)和高剂量组(60 mg/kg)。模型制备[4]：腹腔注射1.2%乌拉坦实施麻醉后，连接心电图进行心电监测，取仰卧位、剥离气管并插管、连接动物呼吸机，开胸并剥离左冠状动脉，夹闭前降支，心电图示ST段抬高或T波高耸为心肌缺血；30 min后松开动脉夹恢复冠状动脉前降支血流灌注，ST段或T波恢复提示心肌再灌注成功。除不夹闭血管外，假手术组操作同模型组。各组每日1次腹腔注射给予相应浓度药物，模型组和假手术组给予0.9%氯化钠溶液，疗程7 d。

1.3.2 心肌梗死体积计算 各组随机取6只大鼠，麻醉后开胸取心脏组织，置-20 ℃冰箱冻存0.5 h，之后进行心脏组织切片，取厚度2 mm，浸入37 ℃恒温浓度1%的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，避光孵育0.5 h，每5 min翻动切片一次使之均匀着色。染色后灰白色为心肌梗死区，红色为正常组织，拍照后应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算心肌梗死体积。

1.3.3 苏木精-伊红(HE)染色法进行心肌组织病理学检查及TUNEL法观察心肌细胞凋亡 各组随机取6只大鼠，取心脏组织后置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，之后经切片、脱蜡、HE染色、脱水、封片等处理后，通过光学显微镜观察心肌组织细胞形态结构改变。取石蜡切片，按照TUENL试剂盒方法步骤处理后，通过光学显微镜观察心肌细胞凋亡状态，显微镜下计算视野内细胞总数和凋亡细胞数，每张切片随机取5个不重叠的视野，分别取细胞总数和凋亡细胞数平均值，计算凋亡指数(AI)：AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.3.4 免疫蛋白印迹法检测蛋白表达 取各组剩余8只大鼠，麻醉后开胸取心脏并剪取心室部位，剪碎后加入9倍量蛋白裂解液，冰水浴中研磨匀浆，低温(4 ℃)12 000 r/min离心15 min处理，蛋白质定量(BCA)法行蛋白定量后实施高温蛋白变性，电泳。待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3、β-actin(1∶500)4 ℃过夜；洗膜，二抗(1∶100)室温摇床上孵育1 h后经增强化学发光法(ECL)显色。根据条带灰度值，以β-actin为内参半定量分析Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表达。

2 结 果

2.1 各组大鼠心电监测结果 除假手术组外，其余各组大鼠造模过程，夹闭左冠状动脉前降支后左心室前壁呈灰白而后逐渐呈现发绀症状，心电图示ST段抬高或T波高耸，30 min后松开动脉夹恢复前降支血流，提示造模成功。与模型组比较，经银杏内酯B治疗7 d后，缺血再灌注损伤大鼠心电图波形明显改善，其中银杏内酯B高剂量组心电波形基本恢复正常。详见图1。

A为假手术组；B为模型组；C为银杏内酯B低剂量组；D为银杏内酯B中剂量组；E为银杏内酯B高剂量组

图1各组大鼠心电图

2.2 各组大鼠心肌梗死体积比较 模型组大鼠心肌组织梗死体积较假手术组显著升高(44.8±5.9)%与(0.0±0.0)%，P<0.01；银杏内酯B低剂量组、中剂量组、高剂量组梗死体积分别为(40.1±7.3)%、(31.7±6.0)%、(22.3±4.5)%，与模型组比较，银杏内酯B中剂量组、高剂量组心肌梗死体积显著降低(P<0.05或P<0.01)。

2.3 各组大鼠心肌组织病理学检查结果 与假手术组比较，模型组心肌组织肌原纤维断裂，细胞排列紊乱，部分细胞出现空泡变性，胞浆着色不均，胞核固缩、深染、界限不清等病理性改变；与模型组比较，银杏内酯B低剂量组、中剂量组、高剂量组上述病理性改变呈不同程度改善，以银杏内酯B高剂量组效果最显著。详见图2。

A为假手术组；B为模型组；C为银杏内酯B低剂量组；D为银杏内酯B中剂量组；E为银杏内酯B高剂量组

图2各组大鼠心肌组织形态(HE，×200)

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡状况 与模型组比较，银杏内酯B低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡细胞数量明显减少，以高剂量组最为显著。模型组心肌细胞AI较假手术组显著升高[(57.4±9.8)%与(0.0±0.0)%，P<0.01]；银杏内酯B低剂量组、中剂量组、高剂量组AI分别为(44.9±8.5)%、(38.9±7.4)%、(26.4±6.1)%，与模型组比较，银杏内酯B中剂量组、高剂量组AI显著降低(P<0.05或P<0.01)。详见图3。

A为假手术组；B为模型组；C为银杏内酯B低剂量组；D为银杏内酯B中剂量组；E为银杏内酯B高剂量组

图3各组大鼠心肌细胞凋亡状况(TUNEL，×400)

2.5 各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达 与假手术组比较，模型组大鼠Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3显著上调、且Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，银杏内酯B中剂量组、高剂量组Bcl-2表达上调(P<0.05或P<0.01)；Bax、激活型Caspase-3下调(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2/Bax升高(P<0.01)。详见图4和表1。

A为假手术组；B为模型组；C为银杏内酯B低剂量组；D为银杏内酯B中剂量组；E为银杏内酯B高剂量组

图4各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表达

表1 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表达(±s)

与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

目前，及时溶栓实现血流恢复灌注是急性心肌梗死(AMI)的主要治疗方案，再灌注损伤严重影响AMI预后。既往多项研究表明，心功能异常、氧化应激损伤、炎症反应及继发性心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤发生发展的重要病理机制[5-9]。

本研究通过结扎左冠状动脉前降支方法制作缺血再灌注损伤大鼠模型，该造模方法操作简单、成功率高且与临床AMI症状接近，是常用的造模方法[10]。本研究结果显示：银杏内酯B治疗能改善心电图波形，抑制心肌组织细胞病变和细胞凋亡，减小梗死体积，说明银杏内酯B可抑制心肌缺血再灌注损伤。

激活型Caspase-3在细胞凋亡启动及后续过程中均发挥重要作用[11]；Bcl-2通过抑制Caspase-3激活、阻止细胞色素C释放、降低细胞内钙浓度从而表现出抑凋亡作用[12]；Bax通过破坏线粒体渗透性、激活Caspase-3表现出促凋亡作用[13]；且Bax与Bcl-2聚合成二聚体相互抑制活性，因此，Bax/Bcl-2比值能实现二者对细胞凋亡的调控作用[14]。本研究结果显示：经银杏内酯B治疗心肌缺血再灌注能上调抑凋亡Bcl-2表达，下调促凋亡Bax和激活型Caspase-3表达，提高Bcl-2/Bax比值，这可能是银杏内酯B抑制细胞凋亡的重要分子机制。

综上所述，银杏内酯B通过调节凋亡相关蛋白表达，从而抑制再灌注损伤后心肌细胞凋亡。