复方苦参注射液对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响

刘清，阳卫立，王伟，海丽娜，罗永胜，胡双成

肝癌是常见的一种恶性肿瘤，病情一旦确诊，80%以上的患者已经处于疾病发展的中晚期阶段，且错过手术切除治疗的最好机会，经肝动脉化疗栓塞术已成非手术治疗肝癌的主要手段，但5年内患者生存率仅在10%左右，而且很多患者无法耐受其对机体的毒副作用如骨髓抑制、免疫抑制、胃肠道反应等，另有部分患者单药治疗效果不佳，多药联合化疗可减少肿瘤的耐药性，提高治疗效果［1］。目前发现中医药治疗具有巨大潜力［2］，大量的临床研究证实复方苦参注射液在治疗恶性肿瘤、缓解癌性疼痛、与化疗药联合应用在抗癌增效、降低放化疗的毒性等方面均具有很好的疗效［3］。复方苦参注射液是由苦参和白土苓经现代化工艺加工制成的纯中药制剂［4］，经高效液相法表明其主要有效成分为苦参碱（M）和氧化苦参碱（OMT）。有研究表明M、OMT有明显的抗肿瘤作用［5-6］，对肺癌、卵巢癌、白血病等细胞生长具有抑制作用，这种作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关［6-8］。林丽珠等［9］研究发现一定浓度的复方苦参注射液对肺癌LAC、Iewis细胞和肝癌Hep、H22肿瘤细胞增殖均具有明显的抑制作用。邹姝姝等［10］研究了苦参碱对肝癌细胞的作用结果表明不同浓度的苦参碱具有抑制肝癌H22细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡的作用，呈明显的时间、剂量依赖性。但还没有文献报道复方苦参注射液对肝癌细胞H22荷瘤模型的作用，因此我们通过动物实验研究复方苦参注射液对肝癌H22细胞荷瘤动物模型抑瘤作用及生存期的影响，进而探索复方苦参注射液在治疗肝癌上的应用前景。

本研究旨在探讨复方苦参注射液抑制小鼠肝癌细胞H22增殖的影响，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肝癌细胞株H22购自中国医学科学院细胞资源平台。复方苦参注射液购于山西振东制药公司，国药准字号Z14021230，批号20140806。昆明种小鼠172只，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，清洁级实验室喂养。环磷酰胺粉剂，20 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司；氟脲嘧啶注射液，10 mL/支，上海旭东海普药业有限公司。

1.2 移植瘤模型的建立

先取小鼠4只，体重18～22 g，从液氮罐中取出H22小鼠细胞株解冻，用无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×106/mL瘤细胞悬液，在无菌操作下对小鼠进行腹腔接种，待腹水生长旺盛时，抽取约3～5 mL腹水（乳白色）放入无菌容器内（冰浴袋上操作），加无菌生理盐水稀释，然后用细胞离心机以转速1 500 r/min离心5 min，用蒸馏水冲洗2次后，收集细胞，经台盼蓝排斥试验检查，细胞成活率95%以上，加无菌生理盐水调整为瘤细胞浓度2×107/mL，然后在小鼠腋下皮下注射，每只接种0.2 mL。

1.3 小鼠H22肝癌实体瘤的抑瘤作用研究

复方苦参注射液设35、30、15、7.5、3.75 g生药/kg5个剂量组，阳性对照药环磷酰胺为30 mg/kg。小鼠右腋皮下无菌接种H22腹水瘤瘤株（含1×106个瘤细胞/只），接种后次日按体重随机分为7组，即：①模型对照组，②环磷酰胺组，③—⑦复方苦参注射液35、30、15、7.5、3.75 g生药/kg。复方苦参注射液组、环磷酰胺组、模型对照组均为腹腔注射给药。各组动物均于接种后24 h开始给药，复方苦参注射液各剂量组每日腹腔注射给药1次，连续给药12 d，阳性药环磷酰胺隔日腹腔注射给药1次，共6次。各组小鼠于最后一次药后24 h称重、处死小鼠剥离瘤体称重。计算各组动物的平均瘤重及抑瘤百分率。瘤重抑制率（%）=（模型对照组瘤重-给药组瘤重）/模型对照组瘤重×100%。

1.4 H22肝腹水癌小鼠生存期研究

复方苦参注射液第一批试验设30、15、7.5、3.75、1.88 g生药/kg 5个剂量组，阳性对照药氟尿嘧啶剂量为30 mg/kg。小鼠腹腔无菌接种H22肝腹水瘤瘤株（含106瘤细胞/只），接种后次日按体重随机分为7组，即：①模型对照组，②氟尿嘧啶组，③-⑦复方苦参注射液30、15、7.5、3.75、1.88 g生药/kg。各组小鼠均于接种后24 h开始给药，连续给药12 d后停药。复方苦参注射液组和模型对照组，给药体积为0.1 mL/10 g体重，1次/d。氟尿嘧啶组隔日腹腔注射给药1次，0.1 mL/10 g体重。将第1次给药作为第1天，连续45 d观察记录各组小鼠每日的死亡数量。若小鼠45 d后未死亡，则存活天数按45 d计算。生命延长率（%）=（给药组动物存活天数-模型对照组动物存活天数）/模型对照组动物存活天数×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对研究数据进行处理。计量资料以¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方苦参注射液对小鼠H22肝癌实体瘤的抑瘤作用

复方苦参注射液各剂量组均可明显抑制小鼠肝癌H22移植性肿瘤的瘤重，经方差分析各组数据方差齐且组间有差异（与模型对照组比较P＜0.05），瘤重抑制率在39.63～56.71%之间。结果提示，复方苦参注射液35、30、15、7.5、3.75 g生药/kg 5个剂量组对小鼠肝癌H22瘤株均具有明显的抑瘤作用，且显示出明显的量效关系。试验阳性药环磷酰胺30 mg/kg对小鼠肝癌H22移植性肿瘤的抑瘤率为68.90%，显示出非常显著的抑瘤作用。见表1。

2.2 复方苦参注射液对H22肝腹水癌小鼠生存期的影响

复方苦参注射液各流量组对H22肝腹水癌小鼠的存活天数有明显的延长作用，生命延长率可达57.71～86.28%；经方差分析各组数据方差齐且组间有差异（与模型对照组比较P＜0.05）。结果提示复方苦参注射液有明显延长肝腹水癌小鼠生存期的作用。阳性药氟尿嘧啶则可非常显著延长肝腹水癌小鼠的生存期，对生命的延长率可达到170.55%。见表2。

表1 复方苦参注射液对小鼠肝癌H22移植性实体肿瘤的抑瘤作用

表2 复方苦参注射液对H22肝腹水癌小鼠生存期的影响

3 讨论

复方苦参注射液是由苦参和白茯苓经过提取分离而成的注射剂，其主要成分为苦参碱、氧化苦参碱，槐定碱、氧化槐定碱等［4］。既往研究显示，苦参碱具有良好的抗小鼠肝癌细胞增殖的作用［5-8］。

复方苦参注射液临床上主要用于中晚期恶性肿瘤患者的治疗。主要药效学试验及临床研究结论：该药具有较好的镇痛作用、止血作用，以及抗炎、抗渗出、抗纤维化作用，且毒副反应轻微，主要适应于轻、中度癌痛［11-12］；对于肝癌［13］、肺癌［14-15］、乳腺癌［2］、消化道肿瘤［16-17］有一定的治疗作用，还可以保护多种脏器免受放化疗损伤，作为重度癌痛及癌症患者的辅助用药，改善生活质量尤为明显［18-19］。曹军等［20］观察复方苦参注射液联合TACE临床疗效及毒副反应，发现治疗组治疗中晚期肝癌能明显缓解肝区疼痛，提高KPS评分，减轻了药物的毒副作用、保护及提高了机体的免疫功能，改善了患者的生活质量。于明磊等［21］发现复方苦参注射液能提高肝癌（肝胆湿热型）TACE治疗率，改善生存质量，延长生存期，多次治疗能提高疗效，并且安全可靠，能减轻化疗毒副作用。陈国唤等［22］发现复方苦参注射液辅助双介入治疗原发性肝癌可提高远期生存率，调节免疫水平，改善生活质量，减轻不良反应。但是复方苦参注射液对小鼠肝癌荷瘤模型的药效还缺乏系统的研究。本研究发现，复方苦参注射液也能显著抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖，与文献报道相符。但究竟是哪一种成分还是这些成分协同作用起到了抗肿瘤的作用，尚需进一步研究。

为探索复方苦参注射液在不同浓度和时间下对小鼠肝癌细胞H22细胞增殖的影响，我们在实验中设置了复方苦参注射液的不同浓度组，实验结果显示，复方苦参注射液总生物碱终浓度在0.5～4 mg/mL条件下，随药物浓度的增加、作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率逐渐上升，呈药物浓度、作用时间依赖。小鼠肝癌细胞H22细胞经复方苦参注射液作用24 h后，复方苦参注射液对小鼠肝癌细胞H22细胞增殖具有明显的抑制作用，作用48 h后抑制作用更加明显，这可能与药物可促进细胞凋亡有关。复方苦参注射液对小鼠肝癌H22移植性肿瘤具有明显的抑制作用并能显著延长生存期，且呈现出明显的量效关系。推测复方苦参注射液能通过相关的信号通路诱导H22细胞凋亡，同时有一定的G1期抑制作用相关。同时应该也有一定的免疫调节作用。

综上所述，复方苦参注射液对小鼠肝癌H22移植性肿瘤具有明显的抑制作用，并能显著延长H22肝腹水癌小鼠的生存期，呈现出明显的浓度依赖性。本结果为阐明复方苦参注射液的抗癌作用机制提供了可靠的实验依据，但复方苦参注射液抑制小鼠肝癌细胞H22增殖通过什么样的信号通路在起作用，值得进一步研究。