半根交替干旱胁迫对大豆农艺性状及籽粒代谢物的影响

谢丛薇，张潇文，杨才琼，胡宝予，杨 峰，王小春，刘 江，3，杨文钰，张 静

（1.农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，成都 611130；2.四川省作物带状复合种植工程技术研究中心，成都 611130；3.四川农业大学生态农业研究所，成都 611130）

间作套种（复合种植）是一种集约化的农业生产模式，能够提高资源利用率，实现农业高产高效。近年来，国内间套作大豆种植面积不断扩大，创造了良好的经济、社会和生态效益，成为缓解国内大豆危机的生力军[1]。在间套作系统中，低位作物大豆单侧受到高位作物的遮挡，其地下部单侧土壤含水量低于另一侧，形成了特殊的半根干旱胁迫现象；而大豆对水分亏缺较敏感，干旱胁迫是制约其生产的主要因素[2-3]。考察特殊生长环境中大豆生理代谢和品质性状的变化，对探究大豆次生代谢产物的抗逆功能，阐明大豆抗旱机理有重要意义。利用这类异质性水分胁迫，延伸形成了根系分区灌溉技术，其作为一种新型的农业节水技术而备受关注[4-5]。该技术使植物不同区域根系受到交替的水分胁迫，利用根系的吸收补偿效应及干旱胁迫信号脱落酸的响应调控，提高植物对土壤养分和水分的利用率，减少无效的蒸腾耗水及棵间蒸发[6-7]。根系分区灌溉技术已广泛运用在果树[8-10]、蔬菜[11-13]、粮食作物[14-15]等研究上。刘贤赵等[8]发现，采用适宜的交替周期对苹果树进行分区灌溉，可在不显著降低产量的前提下，有效节水并明显提升果实品质；分区灌溉对根系生长也有积极作用，合理的交替灌溉方式有利于植物根系构型的建成并保持较高的根系活力[9]；王金凤等[15]也发现交替1/2 根系区域灌水能为玉米创造良好的土壤孔隙通气条件，对土壤微生物的繁殖也有积极意义；土壤含水量的控制对光合产物的积累具有重要影响，分区交替灌溉处理可显著降低玉米灌浆期穗位叶的蒸腾速率，延缓叶片衰老，从而提高光合速率，有益于弱势粒灌浆[5]。可见，目前在研究半根干旱胁迫下作物的外部形态建成、内部响应机制、光合生理特性等方面已取得较大的进展，但是少见关于大豆根系分区灌溉的报道。大豆作为一种需水量较大的作物，不同生育阶段的水分亏缺对大豆产量、品质均有较大影响[16]。间套作大豆受到高位作物的影响，其根系产生了人为的半根干旱胁迫现象，这种异质性胁迫提高了间套作系统的水分利用率，但其对大豆生理和品质性状的影响尚不清楚。本研究通过室内盆栽试验模拟复合种植模式下大豆生殖生长期半根干旱胁迫现象，考察了半根交替干旱胁迫对大豆主要农艺性状的影响；并基于代谢组学方法，探究了大豆籽粒化学成分受到的影响，以期为大豆抗旱机理及复合种植大豆天然产物的开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料选用耐旱性差异显著的2 个大豆品种ND12（耐旱型）和C103（干旱敏感型），由四川农业大学作物栽培与耕作学系提供。

1.2 试验设计

本试验于2017年6月在四川农业大学教学农场进行，采用两因素随机区组设计，因素A 为不同大豆品种C103 和ND12；因素B 为不同水分胁迫方式。采用盆栽试验，先于土壤基质中育苗，土壤基质采用以1∶1 比例混匀并均匀过筛的营养土和田间自然土壤。在子叶展开期（VC 期）将其转移至水培箱中，待其达到第一复叶期（V1 时期）时，分别取生长一致的健壮植株8 株，剪掉主根2 cm 以下部分，将须根均匀分为两部分移植于分根箱中，分根箱为两格，每格长265 mm，宽350 mm，高130 mm，并每日正常浇水以保证大豆正常生长；待植株于分根箱中生长到全荚期（R4 期）时，每日 18：00—19：00 测定土壤水分含量，以土壤含水量低于10%为标准，对处理组植株实行两侧交替浇水100 mL，进行半根交替干旱胁迫；对照组两侧均正常浇水100 mL，处理组与对照组浇水频率保持一致。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 农艺性状测定

于大豆完熟期（R8 期）收获大豆，并分别进行考种，测定株高、茎粗、主茎分枝数、主茎节数、单株荚数及有效荚数、单株粒数、百粒重、单株产量。

1.3.2 代谢组学分析

样品制备。大豆籽粒经粉样机粉碎，过60 目筛，取适量豆粉于铝盒中，置40℃真空干燥机干燥24 h，冷却至室温；准确称量30 mg 豆粉至2 mL 带盖离心管中，加入80%甲醇水溶液1.5 mL（料液比1:40）；密封，漩涡震荡10 s；于冰水浴上超声（40 kHz，300 W）提取3 h，1 1000 g 离心10 min，取上清液约1.5 mL过0.22 μm 有机相滤头至2 mL 进样瓶，即为供试样品溶液，-20 ℃保存，待上机检测。

LC-MS 分析。测试方法在本课题组原有方法的基础上作进一步优化[1]，采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪（UPLC/Q-TOF-MS），其中高效液相系统为（1290 Infinity，Agilent Technologies），质谱分析仪器为（6545 Q-TOF LC/MS）。液相条件如下：色谱柱为 Agilent Eclipse Plus-C18 column（50x2.1 mm，1.8 μm），柱温 35 ℃；流动相 A 和流动相 B 分别为含0.1%甲酸的乙腈混合溶液和0.1%甲酸水溶液；流速设为0.300 mL/min，进样量为1 μL；梯度洗脱方案如下：0～4 min，85%～78%；4～10.5 min，78%～61%；10.5 ～13 min，61%～56%；13 ～17.5 min，56%～5%；17.5～20 min，5%～0；20～25 min，0～85%。质谱扫描方式：正离子模式扫描，喷雾器压力20 psig；扫描频率1 s/spectra；各气路均使用氮气，干燥气流速度为10 L/min，干燥气温度为350 ℃。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013 软件整理数据、绘图；采用GraphPad Prism 7 软件进行差异显著性分析。使用Agilent-Mass Hunter 工作站软件，进行分子特征提取，采用SIMCA-P 13.0 进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），构建分类模型；使用 XCMS-online 进行数据筛选、通路分析[17]。

2 结果与分析

2.1 农艺性状

对抗旱性差异显著的两个大豆品种的农艺性状进行比较分析，结果如表1所示。相较于正常灌溉（对照），半根交替干旱胁迫下，抗性大豆品种ND12 所有农艺性状指标均呈现不同程度下调；单株有效荚数、分枝数、单株产量和百粒重的降低幅度最大，分别达到27.9%、26.7%、24.8%和17.5%。对于干旱敏感型品种C103 而言，半根交替干旱胁迫下，其单株产量、有效荚数、百粒重、单株荚数、单株粒数也呈现不同程度的下调，降低幅度分别达到27.0%、18.7%、15.2%、13.4%和 13.1%；而分枝数、茎粗、主茎节数、株高却出现小幅上调，但均未达到差异显著水平。对于多数农艺性状而言，上述两个大豆品种受到半根交替干旱胁迫的影响，其差异并不显著，仅单株产量和百粒重分别在0.05 和0.01 水平具有显著差异。

表1 半根交替干旱胁迫对大豆农艺性状的影响Table 1 Effect of alternating split-root drought stress on the agronomic characters of soybean plant

2.2 代谢组学分析

基于超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）一级质谱全扫描模式，共提取得到1744 个分子特征（molecular feature），将这些分子特征导入SIMCA-P 进行最小二乘判别分析 （PLSDA），其得分图如图1所示。由图1可知，供试的4类材料被划分为3 组，其中主成分 1 将 ND12 和C103 区分开，而主成分2 将C103 处理组与其正常灌溉对照区分开。由此可知，供试的两个大豆品种籽粒代谢群体受到半根交替干旱胁迫的影响程度不同：PLS-DA 未能将抗旱性大豆品种ND12 的代谢群体明显分离，其受到胁迫的影响较小；而干旱敏感型大豆C103 籽粒代谢群体通过PLS-DA 得到了明显的分离，其受到胁迫的影响较大。

图1 半根交替干旱胁迫对大豆籽粒代谢群体的影响（PLS-DA 得分图）Figure 1 Effect of alternating split-root drought stress on the metabolites of soybean seed （PLS-DA score plot）

同时，对不同抗性大豆材料所提取到的分子特征进行差异显著性分析及倍性分析，以对照处理间差异显著性P 值≤0.01 及相对含量倍性变化≥1.5倍为限制条件，从ND12 籽粒中共提取获得121 个差异分子特征；在C103 籽粒中共提取获得511 个差异分子特征（图2）。由此可知，C103 中差异代谢物显著多于ND12，也进一步证实了C103 籽粒受半根交替干旱胁迫影响，其代谢物的变化更为剧烈。将上述差异分子特征投射到色谱图中（图2），可以看出，不同抗性大豆受到胁迫，其籽粒代谢物的变化差异主要存在于高极性部分（0～5 min），且主要以上调为主；由此推测敏感型大豆C103 受到半根交替干旱胁迫影响，其高极性化合物含量可能增加。

进一步地，对筛选获得的在C103 处理-对照间具有显著差异的分子特征的精确质量数进行数据库检索和定性分析，并对这些差异代谢物进行通路分析，结果如图3所示。由图3可知，C103 籽粒中受到半根交替干旱胁迫影响最大的代谢通路为大豆皂苷合成（soybean saponin I biosynthesis）、丙酮醛降解（methylglyoxal degradation I）、 木质素糖苷合成（monolignol glucosides biosynthesis）及苯丙氨酸合成（phenylpropanoid biosynthesis）通路（图3-b）。

图2 差异分子特征分布图Figure 2 Cloud plots of significant different molecular features

C103 籽粒受半根交替干旱胁迫影响，差异代谢物的相对含量变化情况如图4所示。由图4可知，受到胁迫后，C103 籽粒皂苷合成通路上调，其中以大豆皂苷B（soyasapogenol B）、大豆皂苷B-3-O-葡萄糖苷（soyasapogenol B-3-O-β-glucuronide）、大豆皂苷 I（soyasaponin I）、大豆皂苷 III（soyasaponin III）的相对含量增加最显著；丙酮醛降解通路上调，主要涉及（R）-S-乳酰谷胱甘肽（（R）-S-lactoylglutathione）和谷胱甘肽（glutathione）含量的显著上升；木质素糖苷合成通路上调，主要涉及二羟基松柏醇（dihydroconiferyl alcohol）、芥子醛（sinapaldehyde）和芥子醛葡萄糖苷（sinapaldehyde glucoside）含量的显著上升；苯丙氨酸合成通路上调，主要涉及4-酰基莽草酸酯（4-coumaroylshikimate）、松柏醇（coniferyl alcohol）、芥子醛（sinapaldehyde）和p-酰基奎宁酸（p-Coumaroyl quinic acid）含量的显著上升。

图3 C103 籽粒差异代谢物通路分析Figure 3 Pathway analyses of different metabolites in C103 seeds

图4 C103 籽粒差异代谢物箱式图Figure 4 Box and whisker plots of the significantly different metabolites in C103 seeds

3 讨论与结论

大豆需水量多，水分亏缺会制约其生长发育，在苗期、花荚期及鼓粒成熟期对其产量构成因素产生不同的影响。本研究对不同的灌溉方式下，两个耐旱性差异显著的大豆品种ND12 （耐旱型）和C103（干旱敏感型）的多项农艺性状进行了对比分析。两个品种大豆的产量指标均受到严重影响的原因可能是，结荚期干旱导致大豆生殖器官水势降低，从而抑制了豆荚的生长[18]；而半根交替干旱胁迫下，供试大豆单株荚数、有效荚数和单株粒数的大幅降低也证实了该推断；结荚期干旱对大豆后期的生物量及其分配会产生较大影响，干旱降低了大豆收获指数[19]。

两个大豆品种的籽粒代谢组学分析表明，干旱敏感型大豆籽粒化学成分对干旱胁迫的响应更加剧烈，这或可以通过籽粒代谢群体的变化情况，为抗旱性大豆种质资源的筛选提供参考，这在耐荫型大豆品种的选育中有类似的报道[17]。大豆皂苷为齐墩果烷型三萜皂苷，具有增强免疫调节功能、抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗糖尿病和调节脑血管系统等多种功能，是大豆籽粒的主要活性成分之一[20]。谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的天然活性肽，具有清除自由基、解毒等重要的生理功能[21]；其在还原硫的贮存和运输、蛋白质合成及植物抗逆性方面均有重要作用，抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统是植物体内清除自由基的重要途径[22]，在植物抗逆性方面均有重要作用[23]。半根干旱胁迫下，虽然大豆产量性状降低，但大豆皂苷和谷胱甘肽等重要品质性状均呈显著上调趋势；未来有望通过适度的半根干旱栽培模式，在维持大豆正常生长的前提下，提高大豆皂苷及谷胱甘肽等功能性成分含量。

另外，木质素代谢是苯丙烷代谢通路的重要支路，受到胁迫后，大豆籽粒的木质素糖苷合成通路及苯丙氨酸合成通路显著上调；其背后涉及到的松柏醇、芥子醛等代谢产物均为木质素合成的中间产物，这表明，半根交替干旱胁迫下，大豆籽粒木质化程度加剧。木质素作为一种天然高分子聚合物，与细胞壁中的纤维素、 半纤维素等多糖分子相互交联，增加了植物细胞和组织的机械强度，对细胞壁的机械支持特性具有重要作用[24]；半根交替干旱胁迫下大豆籽粒木质化程度的加剧可能是大豆实现其代际间非生物胁迫应对策略的重要组成部分，这还有待进一步研究。

本试验通过对处理组植株采用两侧交替浇水实现半根干旱胁迫，对照组正常浇水且与处理组浇水频率保持一致，保证了对照组与处理组浇水侧的土壤田间持水量基本处于同一水平。但分区交替浇水量的设计比较单一，未考虑到部分干旱的情况，给予了植株一侧根系完全的干旱，可能对大豆的正常生长发育产生了不利影响。未来将设置梯度式灌水量，通过多个水分处理组合明确最适宜植株生长的分区交替处理。

两个品种间各项指标的变化趋势存在差异，与正常灌溉相比，半根交替干旱胁迫下，抗性品种ND12 受到的影响相对更大，其株高、茎粗、分枝数、主茎节数等各项外观性状呈下降趋势，但均未达到差异显著水平；而敏感型品种C103 却出现了小幅增长。产量性状方面，两个大豆品种的百粒重均极显著降低，单株产量显著降低，且ND12 的降幅低于C103。

代谢组学分析发现，C103 籽粒中的差异代谢物显著多于ND12，变幅更大，表明干旱敏感型大豆籽粒化学成分对胁迫的响应更剧烈；其中几种差异代谢物的相对含量变化显示，籽粒中皂苷合成通路及丙酮醛降解通路呈上调趋势，大豆皂苷和谷胱甘肽等重要品质性状均显著提升。木质素糖苷合成通路上调，松柏醇、芥子醛等相对含量显著上升，表明C103 籽粒的木质化程度加剧。