冬小麦抗寒性鉴定的低温处理方式和鉴定指标的研究

李 桐，付连双，刘 鑫，李卓夫，秦 鹏，张占国，王晓楠

(1.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨 150030; 2.寒地粮食作物种质创新与生理生态教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；3.东北农业大学理学院，黑龙江哈尔滨 150030)

黑龙江位于中国的最北部，其气候寒冷，冬季最低气温能够达到-30 ℃，因此只有抗寒性极强的冬小麦品种才能在此地安全越冬[18]。抗寒性鉴定包括越冬后田间调查成活率、室内低温处理及生理指标间接鉴定[19-20]。田间调查成活率所需的时间较长且受不同年份间气候不稳定的影响，有时不能真实反映品种的抗寒性，因此室内低温处理结合生理生化指标或分子辅助育种手段常用于小麦抗寒性快速鉴定[21-22]。如赵瑞玲[23]对209份小麦材料给予在-8～-16 ℃范围连续的降温处理，每2 ℃为一个梯度，每个温度作用3 h，低温处理后调查成活率，鉴定出8份抗寒材料。张淑霞等[24]室内模拟田间0～-32 ℃低温，每隔2 ℃为一个梯度，低温处理后恢复温度，然后调查成活率，Logistic方程拟合返青成活率曲线。前人关于室内低温处理方式的研究多为梯度缓慢降温，关于连续低温对植株的影响研究尚未见报道。本研究以抗寒性不同的小麦品种为材料，设置室内快速低温、缓慢低温和大田种植三种温度处理，检测SOD、POD、CAT、APX活性及ASA、GSH、MDA和H2O2含量等生理指标，分析两种室内低温处理与大田种植间生理指标的相关性及差异，以期明确适合室内抗寒性检测的低温处理方式及生理指标，为室内快速鉴定冬小麦的抗寒性提供依据。

1 材料方法

1.1 试验材料

选取冬小麦抗寒品种东农冬麦1号(由东北农业大学小麦育种所培育，越冬返青率高于80%)、弱抗寒品种济麦22(由山东农业科学院培育，在黑龙江地区种植越冬返青率低于30%)和不抗寒品种中国春(在黑龙江冬季不能越冬，返青率为0%)为供试材料。

1.2 试验设计

大田种植：2015年9月1日种植于东北农业大学校内试验地，田间随机区组设计，3次重复，小麦行长5 m，行距30 cm，10行区，种植密度均为200万株·hm-2。分别在2015年10月15日、10月30日、11月15日(开始进入封冻期)、11月30日、12月15日、12月30日和2016年1月15日取样，每次取样每个品种随机取30株。

室内低温处理：在长40 cm、宽30 cm的白色塑料盆中，每盆40粒种子，放置于光照培养箱中，光照强度为2 000 lx，25 ℃ 16 h光照/18 ℃ 8 h黑暗，生长至3叶1心期时进行冷驯化处理。冷驯化期间植株生长环境设置：光照强度为2 000 lx，10 ℃ 16 h光照/4 ℃ 8 h黑暗。冷驯化30 d后将盆栽转移至-40 ℃美菱低温冰箱进行冷冻处理。快速低温和缓慢低温处理列于表1，取样部位是包含生长点的分蘖节，每次取样30株清洗干净后置于-80 ℃保存。

1.3 测定方法

MDA含量测定参照李合生[25]的方法；H2O2含量、APX活性测定参照邹 琦[26]的方法；SOD、 POD、CAT活性测定参考陈建勋[27]的方法；ASA含量测定参照KAMPFENKEL[28]的方法；GSH含量测定参照MA[29]的方法。

1.4 数据处理

用DPS 7.05分析差异显著性及相关性，用R语言计算欧式距离，用EXCEL制作图。

表1 室内低温处理方式Table 1 Indoor low temperature treatment

图1 田间取样温度

2 结果与分析

2.1 低温下小麦植株的MDA及H2O2含量变化

大田条件下小麦的MDA含量随时间推移呈先升后降再升的变化趋势。3个品种均在11月30日达到第一个峰值，此时中国春(CS)、济麦22(JM22)和东农冬麦1号(DM1)的MDA含量分别为30.11、26.38和33.11 μmol·g-1，但至1月15日，抗寒性最弱的CS的MDA含量达到了32.96 μmol·g-1，而抗寒品种DM1仅为12.64 μmol·g-1(图1)。大田条件下小麦的H2O2含量随着时间推移呈逐渐增高趋势。10月15日3个品种间差异不显著，但之后CS的H2O2含量增加较快，而JM22和DM1增加较慢，至1月15日CS、JM22和DM1的H2O2含量分别为 12.33、11.34和8.97 μmol·g-1FW。

与室内缓慢低温处理相比，室内快速低温处理下，小麦的MDA和H2O2含量均较高，差异均显著(图1)。品种间无论室内快速低温处理还是缓慢低温处理，MDA和H2O2含量均表现为CS>JM22>DM1。

2.2 低温下小麦的活性氧清除酶活性及抗氧化剂含量的变化

大田条件下，3个小麦品种的SOD活性呈先升再降的变化趋势，说明小麦为应对低温在胁迫初期会增加SOD活性。封冻期后3个品种的SOD活性逐渐降低，至1月15日CS、JM22和DM1的SOD活性分别为35.97、55.29 和74.98 U·g-1·min-1。田间的POD活性变化趋势与SOD活性相似，也表现为先升再降的变化趋势。CS、JM22和DM1的POD活性均在11月30日达到最高值，分别为4 044、4 336和4 578 U·g-1·min-1，至1月15日POD活性则分别1 399、2 556和4 039 U·g-1·min-1。

室内-14、-16和-18 ℃低温处理时，SOD活性均表现为缓慢低温处理显著高于快速低温处理，品种间表现为JM22>DM1>CS；而POD活性表现为缓慢低温处理显著低于快速低温处理，品种间表现为DM1>JM22>CS。

3种低温处理下田间种植的CAT活性最低。CS、JM22和DM1的田间CAT活性均在11月30日达到最高值，分别为1 368、1 412和2 161 U·g-1FW·min-1，至封冻期1月15日分别下降为451、449和1 042 U·g-1FW·min-1。CS、JM22和DM1的田间APX含量分别在10月30日、11月30日和11月30日达到最高值，分别为6.47、6.23和10.65 U·g-1FW·min-1，至1月15日CS与JM22差异不明显，但显著低于DM1。田间种植的GSH含量显著高于室内低温处理，CS、JM22和DM1的GSH含量变化范围分别为0.62～3.79、3.15～6.13和3.15～6.54 μg·g-1FW，至1月15日3个品种的GSH含量分别为3.78、5.12和5.84 μg·g-1FW。田间种植的ASA含量呈波动式变化，CS、JM22和DM1的ASA含量均在11月15日均达到最高值，分别为8 676、12 606和17 745 μg·g-1FW。

SK:室内快速低温；SM:室内缓慢低温；DT:田间种植。 CS：中国春；JM22：济麦22；DM1：东农冬麦1号。图柱上的不同字母表示相同品种的不同处理间差异显著(P<0.05)。图例的括号内外数值分别为室内外温度。图3同。

SK:indoor rapid low temperature; SM:indoor slow low temperature; DT:field planting. CS:China Spring; J22:Jimai 22; D1:DongnongDongmai 1.Different letters indicate significant difference among the treatments for a same variety at 0.05 level.The values out and in the brackets are the indoor and outdoor temperatures, respectively. The same in figure 3.

图2 三种低温处理下品种间MDA和H2O2含量的比较分析

Fig.2 Comparative analysis of MDA and H2O2contents among three varieties under low temperature treatments

图3 三种低温处理下品种间活性氧清除物质的含量或活性差异

室内缓慢低温处理下CS的CAT活性高于室内快速低温处理，而JM22和DM1表现为室内快速低温处理高于室内缓慢低温处理；室内低温处理下DM1的APX活性显著高于其他品种， -18 ℃缓慢低温和快速低温处理下CS和JM22间APX活性差异不显著，但显著低于DM1；室内-14、-16、-18 ℃缓慢低温和快速低温处理下ASA和GSH含量均呈DM1>JM22>CS。

2.3 室内两种降温处理方式与大田种植的相关性

相关分析(表1)表明，室内快速低温处理的SOD、CAT活性及MDA、H2O2、ASA含量与大田条件下的测定值均呈极显著正相关，而室内缓慢低温处理的H2O2含量及POD、CAT活性与大田条件下的测定值均显著或极显著正相关。从不同处理间的数据欧氏距离(表3)看，除POD活性外，其余指标均表现为室内快速低温处理与大田种植间的差异小于室内缓慢处理与大田种植间的差异，说明室内快速低温处理与大田种植的数据更为接近。

对所有处理下的小麦不同指标间进行相关分析(表3)表明，MDA含量与GSH含量呈极显著负相关，与H2O2含量呈显著正相关。H2O2含量与ASA含量和SOD活性呈极显著负相关。

表2 室内低温处理的生理指标与大田种植的生理指标相关性Table 2 Correlation between indoor low temperature treatments and field physiological indices

*：P<0.05;**：P<0.01.

表3 室内低温处理各生理指标与大田种植生理指标的欧氏距离Table 3 Euclidean distance between indoor low temperature treatments and field physiological indices

表4 小麦不同生理指标间相关性Table 4 Correlation among different physiological indices of wheat

*：P<0.05;**：P<0.01.

3 讨 论

本研究中，低温下三个小麦品种的MDA含量增加，这与前人的研究基本一致[30]。低温下冬性、春性小麦的MDA含量差异显著。Zhang[31]研究得出，低温下冬小麦品种京河1号、苏引10号的MDA含量均低于弱抗寒的小麦鲁麦22号和春小麦晋春9号，其中春小麦晋春9号的MDA含量最高。本研究中，东农冬麦1号(冬性)<济麦22(弱冬性)<中国春(春性)。室内快速冷冻低温处理的MDA含量要显著高于室内缓慢低温处理的MDA含量，大田条件下只有在12月30日和1月15日中国春的MDA含量接近室内低温处理，而东农冬麦1号和济麦22的MDA含量要显著低于室内低温处理，说明室内低温处理的小麦膜脂过氧化程度较封冻后大田种植严重。