四川地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因突变检测

何继才，杨荣琴，彭睿

(1. 凉山彝族自治州第一人民医院眼科，四川 凉山 615000；2. 四川大学华西医院眼科，成都 610000)

脉络膜黑色素瘤是成年人最常见的眼内恶性肿瘤[1]。约50%的脉络膜黑色素瘤患者发生会发生转移，而目前几乎没有任何有效的治疗方法[2]。在发现肿瘤转移后，患者的生存时间一般少于6个月[3]。

GNAQ和GNA11基因编码Gαq蛋白，其参与调节G蛋白偶联受体和下游的效应器[4]。研究[4]表明：原癌基因GNAQ和GNA11的突变率在白种人中约为80%。这2个基因的突变会导致丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶通路上调，很可能是脉络膜黑色素瘤发生发展的主要因素[5]。然而最近在中国人群中的研究[6]发现：只有约30%的患者有这2个基因的突变。提示基因突变及其在肿瘤发生中的作用可能随人种不同而不同。本研究检测分析了中国四川地区脉络膜黑色素瘤患者的GNAQ和GNA11基因突变情况，旨在明确这两个基因在该地区患者中的突变率。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2011年1月至2016年1月四川大学华西医院以及四川省凉山彝族自治州第一人民医院的22例脉络黑色素瘤患者。纳入标准：年龄性别不限，明确的组织病理学诊断，患者自愿参加本项研究。排除标准：不符合入选标准者；已经或正在接受脉络膜黑色素瘤放射以及药物治疗的患者。诊断依据包括眼底检查、B超检查以及组织病理检查。临床检查主要包括患者年龄、性别、肿瘤厚度、最大基底直径、组织细胞类型、是否侵犯睫状体、是否侵犯视神经、是否发生转移。随访时间不少于3年。本研究严格遵守赫尔辛基宣言，所有临床与实验室检查均取得患者的知情同意，并经四川大学华西医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 DNA 提取及测序

眼球摘除后， 常规进行甲醛固定， 石蜡包埋。 获得石蜡切片后， 通过D N A 提取试剂盒(QIAamp DNA Mini KIT，德国Qiagen 公司)对肿瘤组织进行DNA提取。Primer 5.0 软件设计GNAQ和GNA11的4号和5号外显子的引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列：GNAQ exon5上游引物为5'-GACTTGGATGATCATCGTCATT-3'，下游引物为5'-AAGAAAGCAAAGAAGTAAGTTCAC-3'；GNAQ exon4上游引物为5'-TGTCCTTCCC-T T T C C G T A G A - 3'，下游引物为5'-TGGGAAATAGG-TTTCATGGACT-3'；G N A 1 1 e x o n 5上游引物为5-AGCGTCCTTGCCCGTTCTA-3'，下游引物为5'-AGGGCCCACCTCGTTGTC-3'；G N A 1 1 e x o n 4 上 游 引 物 为5'-GCTGGTTTGGGTGCTGTGT-3'，下游引物为5'-GGCAAATGAGCCTCTCAGTGT-3'。通过PCR反应扩增目标基因，扩增的PCR产物通过ABI PRISM 3.0 Genetic analyzer(ABI，上海生工生物公司)测序。测序结果通过DNAstar软件分析。

2 结果

2.1 临床结果

本研究对22位脉络膜黑色素瘤患者行眼球摘除术。患者年龄为(42.1±14.8)岁，男女比例为12/10(表1)。患者均为单眼发病。在随访期间，7名患者发现了肿瘤转移，其中5名患者为肝转移，2名患者为多器官转移。这7名患者都因肿瘤转移发生死亡，术后存活时间为(424.1±69.33) d。其余未发生肿瘤转移的患者的随访时间均大于3年。

表1 脉络膜黑色素瘤患者的临床及病理情况Table 1 Clinicopathological data of uveal melanoma patients

2.2 基因检测结果

对GNAQ和GNA11基因的4号、5号外显子进行测序。总突变率分别为45.46%，27.28%；其中，GNAQ基因发生Q209P突变的突变率为31.82%，发生Q209L的突变率为13.63%(表2)。没有患者同时发生GNAQ和GNA11基因突变(图1)。

表2 基因突变分布Table 2 Proportion of each mutation type

图1 基因突变位点Figure 1 Mutation sites

3 讨论

在本研究中，脉络膜黑色素瘤发生GNAQ和GNA11基因突变率分别为45.46%和27.28%，总突变率为72.74%。Van Raamsdonk等[4]报道：在高加索人群中，83%的脉络膜黑色素瘤中检测到GNAQ或GNA11突变。本研究结果与之相近。然而，Xu等[6]报道：在中国脉络膜黑色素瘤患者中，GNAQ或GNA11突变率仅为38%(GNAQ：18%；GNA11：20%)。推测其原因如下：1)本研究样本量太小，可能会造成统计误差；2)肿瘤组织长期保存中发生DNA降解，导致测序不准确；3)中国北方人和南方人或者少数民族患者之间可能存在基因差异。由于本研究医院所属地区脉络膜黑色素瘤患者较少，且不易随访，因此样本确实有限。为减小测序误差，所有PCR产物都测序2次，若结果不一致再加测。

脉络膜黑色素瘤的突变负担小于大部分肿瘤，与儿童肿瘤的突变负担相似[7]。而GNAQ和GNA11突变一直被认为是在肿瘤早期发生的突变，并被认为在肿瘤的发生中起重要作用[8-11]。在Van Raamsdonk等[4,12]的报道中，大多数GNAQ和GNA11突变都发生在209密码子，少数发生在183密码子。在本研究中，GNAQ和GNA11突变都发生在209密码子。另外笔者团队[6]也未发现4号外显子突变，这与之前关于中国人群的报道相符。

综上，GNAQ和GNA11基因在四川地区脉络膜黑色素瘤患者中的突变率较高。