白掌疫病病原菌的鉴定

张云霞 曾莎芮 黄耀华 陈灿钿 程东美 向梅梅

摘  要  在致病性测定的基础上，通过形态特征观察及基于特异性引物Pn1和Pn2扩增的DNA序列分析，对在广州发现的白掌疫病的病原菌种类进行了鉴定。结果表明，引起广州白掌疫病的病原菌为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）。研究结果为白掌病害的防控提供了理论依据。

关键词  白掌;疫病;特异引物;烟草疫霉

中图分类号  S436.8      文献标识码  A

Abstract  A strain was isolated from the diseased plants of Spathiphyllum sp. from Guangzhou. The Pathogenicity test showed the isolated strain was the pathogenic fugus of Spathiphyllum blight. The pathogenic strain was identified according to the morphology， rDNA internal transcribed spacer sequencing amplified by Pn1和Pn2. The result showed Phytophthora blight of Spathiphyllum from Guangzhou was caused by Phytophthora nicotianae. The result would provide a foundation for effective control of the disease.

Keywords  Spathiphyllum sp. ; Phytophthora blight; specific primer; Phytophthora nicotianae

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.019

白掌（Spathiphyllum spp.），又称白鹤芋、苞叶芋，属于天南星科（Acreare），白鹤芋属（Spathiphyllum），为多年生草本植物。白掌原产于美洲，20世纪80年代末引入中国。因其花型独特，有“一帆风顺”寓意，广受消费者喜爱。广东是白掌的主产地，近年来，作为主要的小盆栽观叶植物，白掌的种植面积逐年增加。

作者在白掌病害调查中发现，广州某生产基地大面积发生疫病，受害植株茎基部腐烂，死亡率高达50%以上。为明确该病害的病原菌種类，为病害的防控提供理论依据，本研究对其病原菌进行了鉴定。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试植株  病株样品采自广州某生产基地的大花白掌。接种植株为健康的大花白掌。

1.1.2   供试培养基  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于菌株的分离培养和菌种的保存，马铃薯葡萄糖（PD）培养液用于接种菌丝的培养，水琼脂（WA）培养基用于单菌丝分离，V8汁培养基用于疫霉孢子囊和卵孢子的诱导。

1.2  方法

1.2.1   病原菌的分离纯化  采用组织分离法进行病原菌的分离[5]。具体方法如下：选取典型的病组织，自来水冲洗，晾干，于病健交界处切取3～5 mm2的若干小块，依次于75%酒精消毒10～20 s、2.5%次氯酸钠溶液消毒10～15 s、无菌水清洗3次;用无菌滤纸吸干组织块表面的水分，将组织块移至PDA平板上，每皿5块，共6皿，于25 ℃恒温箱培养。

菌株的纯化保存：待菌落长出后，挑取菌落边缘的菌丝移至新的PDA平板上纯化;将纯化后的菌株移接至PDA斜面上培养，于13 ℃冰箱保存备用。

单菌丝分离：挑取少量菌丝，接种于WA培养基平板上培养2～3 d后，在光学显微镜下切取单根菌丝，移植于PDA平板上，25 ℃培养。

1.2.2  致病性测定  采用灌根法接种：选取长势一致的健壮幼苗，扒开表层土壤，用PD培养液震荡培养3 d的菌丝悬浮液灌根，再用基质覆盖表层，并套袋保湿，以无菌水灌根为对照，每个处理3次重复。接种植株置于25～28 ℃培养室中培养，观察记录发病情况。

病原菌的再分离：采用常规组织分离法对接种发病植株的病组织进行再分离，并通过菌落形态和显微形态观察确定分离菌株是否与接种菌株一致。

1.2.3  病原菌形态鉴定  菌落特征观察：PDA平板上27 ℃培养5 d后，在菌落边缘用无菌打孔器切取菌饼，移接至新的PDA平板上，菌丝面向下，27 ℃培养，于2、4、6、8 d观察并记录菌落特征，测量菌落直径，计算生长速率[6]。

显微形态特征观察：V8汁平板上培养5 d后，在菌落边缘用无菌打孔器切取菌饼，将菌饼移入无菌培养皿中，每皿5块，菌丝面向上，倒入无菌水至刚好没过菌丝块，25 ℃培养2 d，观察孢子囊及卵孢子形态并测量大小，孢子囊及卵孢子各测30个[6]。

1.2.4  病原菌分子鉴定  真菌基因组DNA的提取：单菌丝菌株于PDA平板上培养3～5 d后，收集菌丝，参照Chi[7]的方法提取DNA。

PCR扩增：分别用ITS的通用引物ITS1和ITS4[8]及烟草疫霉的特异引物Pn1和Pn2[9]进行扩增。PCR反应程序为：94 ℃预热5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次;72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。

DNA序列比对分析：PCR产物经电泳检测后，送至英潍捷基生物有限公司测序，测序结果输入NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行同源性比对。

系统发育树的构建：从NCBI网上下载可信度高的相关序列，用 MEGA 7软件对实验菌株及下载的序列进行比对分析，以Fusarium solani作为外群，通过ML法（Maximum Likehood）构建系统发育树，设1000次重复。

2  结果与分析

2.1  白掌疫病的症状

病原菌沿根基部侵入，受害部位初期呈水渍状，褐色，逐渐扩展至内部;剖开病株假鳞茎，心芽变褐色，病变沿心芽向上扩展;受害植株最初表现叶片下垂、萎蔫，茎基部变褐湿腐，后期植株倒伏死亡。湿度大时，病害扩展迅速，病株几天内倒伏死亡（图1）。

2.2  致病性测定结果

健康植株接种7 d左右，叶片开始变黄、下垂，茎基部逐渐变褐色，湿腐状，并向上蔓延，14 d左右植株倒伏死亡（图2）;剖开假鳞茎，内部呈黑褐色腐烂，与田间症状一致。取接种发病植株进行组织分离，得到的菌株的菌落形态和显微形态与接种菌株基本一致，说明分离菌株为白掌疫病的病原菌。

2.3  病原菌的培养性状及显微形态

菌落白色，絮状，边缘整齐，初期菌丝稀疏，后期较致密（图3A），平均生长速度10 mm/d。孢子囊无色，倒梨形，顶生，具有明显乳突，大小为（21.60～41.06）μm × （13.06～25.84）μm（av. = 31.57 μm × 22.11 μm）（图3B）。卵孢子浅褐色，近圆形，大小为22.84～38.48 μm（av. = 28.44 μm）（图3C）。厚垣孢子少，多間生。

2.4  病原菌的分子鉴定

用真菌通用引物ITS1和ITS4对白掌疫霉病

A：受害植株症状;B：受害植株茎基部;C：受害植株茎基部内部。

用ITS序列构建系统发育树，结果显示：实验菌株（PYA1和PYA2）与Phytophthora nicotianae聚为一支，形成一个明显的分支，表明亲缘关系较近因此，结合形态学特征，将该病原菌鉴定为Phytophthora nicotianae。编号PYA1和PYA2分别为实验菌株ITS1/ITS4和特异引物Pn1/Pn2扩增出来的2个序列，其他为NCBI上下载的可信度高的菌株序列。

3  讨论

本文在致病性测定的基础上，通过形态特征观察及基于特异性引物Pn1和Pn2扩增的ITS序列分析，对在广州发现的白掌疫病的病原菌种类进行了鉴定，明确引起广州某生产基地白掌疫病的病原菌为Pythophthora nicotianae。

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