草鱼细菌性烂鳃病病原菌的分离及其特异性卵黄抗体的初步研究

2 罗玉双2 张保平 张建平2

(1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000； 2.环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，动物学湖南省高校重点实验室，湖南 常德 415000； 3.常德职业技术学院农林工程系，湖南 常德 415000)

细菌性烂鳃病是由柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)引起草鱼的常见疾病。柱状黄杆菌属于黄杆菌目，黄杆菌科，黄杆菌属，具有滑动能力和团聚性，在世界范围内的水体环境和土壤中均有分布，几乎所有的淡水鱼类均对该菌敏感，可导致被感染鱼类出现烂鳃、体表溃疡等症状，使集约化养殖鱼类大规模死亡[1]。

卵黄抗体(IgY)作为1种免疫球蛋白，是1种高产、优质的多克隆抗体。目前已有卵黄抗体针对沙门氏菌[2]、金黄色葡萄球菌[3]、幽门螺杆菌[4]、大肠杆菌[5]等病原菌的相关研究，但针对柱状黄杆菌所进行的免疫学研究资料还很缺乏[6]。本研究以从患典型烂鳃病草鱼病变部位中分离并鉴定的1株柱状黄杆菌(FC-3株)作为免疫原[7]，免疫产蛋母鸡，收取鸡蛋制备特异性IgY，并以此IgY为基础建立间接ELISA检测方法，以期为该菌的检测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器：台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪器有限公司)，多功能微孔板检测仪(北京平皓生物有限公司)，超细匀浆机(河南省巩义市予华仪器有限责任公司)，立式高压蒸汽灭菌锅(申安医疗器械厂)，麦氏比浊管、生化培养箱、超净台(中国上海浦东物理光学仪器厂)，聚苯乙烯酶标板(上海塑料三厂)，移液器(德国Eppendorf)。

1.1.2主要试剂：Shieh营养肉汤培养基、Shieh琼脂培养基(本实验室自制)，细菌微量发酵管(杭州天和有限公司)，福氏完全佐剂与福氏不完全佐剂(Sigma公司)，卡拉胶、低甲氧基果胶(天津市福辰化学试剂厂)，预染低分子量蛋白质Marker(14.4～97.4 ku)、辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡IgY、标准鸡IgY(北京鼎国昌盛生物有限责任公司)，牛血清白蛋白(BSA)、TMB底物显色试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.1.3试验动物：120日龄纯种健康桃源蛋鸡10只，购自桃源县良种场；ICR雌性性成熟小白鼠15只，购自湖南省实验动物中心。

1.1.4试验菌株：柱状黄杆菌分离株(FC-3株)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、哈维氏菌(Vibrioharveyi)均为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1柱状黄杆菌的分离鉴定：无菌条件下取患有典型烂鳃病的草鱼样本病料组织(体表溃烂组织、鳃丝、内脏等)，加入灭菌生理盐水研磨匀浆，无菌操作涂布菌液匀浆于Shieh琼脂培养基，28 ℃培养16～18 h。挑取优势菌落，采用三线法平板划线分离出单菌落，观察菌落形态。取分离的病原菌接种于细菌微量发酵管中，28 ℃培养观察并记录生化反应结果。分离菌进行人工回归试验鉴定致病性。

1.2.2免疫原油佐剂灭活疫苗的制备

1.2.2.1分离菌免疫原处理：将分离菌先用Shieh营养肉汤培养基摇瓶培养18 h，然后再接种于0.05% Shieh琼脂培养基，28 ℃培养16～18 h；用无菌生理盐水轻轻洗下菌苔，加0.4%甲醛溶液 28 ℃灭活48 h。在此过程中每隔2 h摇匀1次，灭活完毕进行无菌检验，再用麦氏比浊管进行计数，将菌液调成浓度1×107～1×108cfu/mL。用超细匀浆机以12 000 r/min搅拌佐剂的同时缓慢加入等量灭活分离菌菌液抗原，待抗原加完后再以 8 000 r/min高速混合2 min。在溶液乳化过程中，以滴在水面上呈油包水状为乳化完全，制成油佐剂疫苗，4 ℃保存备用。

1.2.2.2无菌检测：将制备好的免疫原油佐剂灭活疫苗接种于0.05% Shieh琼脂培养基，置恒温培养箱中28 ℃培养36～48 h，观察结果。

1.2.2.3动物安全性检测：选取健康ICR雌性性成熟小鼠15只，其中5只采用灌服免疫原油佐剂灭活疫苗0.3 mL/只，5只采用肌肉注射0.2 mL/只，5只作为对照组。临床观察小鼠有无异常，72 h后剖检。

1.2.3蛋鸡的免疫：选择120日龄纯种健康桃源蛋鸡10只，分成2组。试验组7只，将分离菌灭活油佐剂苗经鸡翼多点注射。首免采用福氏完全佐剂苗0.5 mL/只进行基础免疫，在首免后的第14 d采用福氏不完全佐剂苗1 mL/只加强免疫1次，第28 d不加佐剂直接 1.5 mL/只进行加强免疫1次。从第7 d开始收集免疫鸡鸡蛋，编号记录后4 ℃保存。对照组3只，不注射免疫原，仅注射PBS乳化剂。

1.2.4IgY的提取：收集新鲜的免疫鸡鸡蛋，用清水洗净蛋壳表面的污物，再浸泡于75%酒精消毒15 min。在超净工作台内破蛋壳，然后用自制的卵黄分离器去除蛋白，将卵黄置于无菌滤纸上吸干残余的蛋白，无菌收集卵黄倒入量筒中。再用无菌蒸馏水稀释卵黄，调节稀释液的pH值到微酸性，用玻棒搅拌20 min，置4 ℃自然沉淀4 h，12 000 r/min低温离心25 min去除脂类，收集上清即为卵黄水溶性组分。将分离的卵黄水溶性组分与等量0.01 mol/L、pH 7.2的PBS混匀，再加4倍体积的脱脂溶液[8](含0.06%卡拉胶，0.18%低甲氧基果胶，10 μmol/L氯化钙)混匀，12 000 r/min、4 ℃离心25 min，弃沉淀取上清；上清再加硫酸铵至终浓度33%(W/V)，混匀，置4 ℃ 1 h，12 000 r/min离心25 min，弃上清取沉淀用PBS溶解，加入硫酸铵至终浓度20%(W/V)，4 ℃ 过夜，12 000 r/min离心25 min，弃上清取沉淀用PBS溶解，得IgY溶液。提纯的IgY样本在12% SDS-PAGE电泳上分离，20 μL/孔加样，考马斯亮蓝R-250染色2 h。脱色直到蛋白条带清晰，凝胶成像系统拍照。

1.2.5间接ELISA方法的建立

1.2.5.1抗原和抗体最佳工作浓度确定：将分离菌1×109cfu/mL用包被液( 0.05 mol/L、pH 9.6)做系列稀释(1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶ 1 600)，纵向包被酶标板，每个浓度包被12个孔，100 μL/孔4 ℃包被过夜。弃去包被液，洗板3次后加入2%BSA封闭液150 μL/孔，37 ℃温育60 min；弃去封闭液，洗板3次，将纯化IgY用抗体稀释液配成10 mg/mL的工作液，将其倍比稀释(1∶ 32，1∶ 64，1∶ 128，1∶ 256，1∶ 512，1∶ 1 024)后分别加入酶标板中，横向100 μL/孔，37 ℃温育120 min；弃一抗并洗板3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标兔抗鸡IgY，1∶ 4 000 稀释100 μL/孔，37 ℃温育60 min；弃二抗并洗板3次，加入TMB显色液100 μL /孔，避光显色20 min。2 mol/L H2SO450 μL/孔终止反应，用酶标仪测定D450 nm值。结果判定：取阳性值在1.000左右，且相邻孔的D450 nm值变化较大。其所对应的阴性值小于0.2，且P/N值最大的孔，此孔所对应抗原和抗体的浓度即为抗原包被最佳浓度和抗体最佳工作浓度。

1.2.5.2HRP标记兔抗鸡IgY工作浓度确定：根据以上试验结果确定抗原的包被浓度，再将纯化的IgY按以上梯度稀释，100 μL/孔纵向加；HRP标记兔抗鸡IgY稀释倍数为1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，将其100 μL/孔横向加，温育时间、操作步骤及结果判定同1.2.5.1。

1.2.5.3实验条件的优化：封闭30、60、90、120 min；一抗30、60、90 min；二抗30、45、60、90 min；底物显色10、15、20、30 min；取阳性值在1.000左右，比较P/N值，筛选最佳反应时间。

1.2.6间接ELISA方法的敏感性：将1×109cfu/mL浓度的分离菌用包被液依次稀释成1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu/mL 5个浓度梯度，100 μL/孔，4 ℃包被过夜。在以上确定的各个最佳条件下进行间接ELISA实验操作，以确定检测分离菌纯培养液的检出限值。

1.2.7间接ELISA方法的特异性：利用建立的间接ELISA方法检测分离菌和常见的淡水鱼致病菌(嗜水气单胞菌、哈维氏菌)。

1.2.8间接ELISA方法的重复性：检测建立的间接ELISA反应方法的批内重复性和批间重复性，实验过程中采集5份卵黄抗体分别经同一批次制备的酶标板和不同批次制备的酶标板进行重复性反应测定。

2 结果

2.1 分离菌鉴定结果分离菌在Shieh琼脂培养基上形成的菌落最初与培养基的颜色相近，随着培养时间的延长逐渐变为淡黄色的、假根状、边缘不整齐、中央较厚的菌落(见图1)。生化检测试验结果显示，分离菌对过氧化氢酶反应阳性，七叶苷反应阳性，不水解酪氨酸，不产生吲哚，不能发酵和利用葡萄糖，鉴定为柱状黄杆菌(命名为FC-3株)。人工回归感染草鱼试验结果表现致病性，并从感染后的病鱼鳃部再次分离到原感染菌，未分离到其他细菌，菌落形态及生化试验结果与菌株FC-3一致。

图1 分离菌FC-3的菌落形态

2.2 免疫原油佐剂灭活疫苗无菌检测结果将制备的免疫原油佐剂灭活疫苗接种于0.05% Shieh固体培养基中，置恒温培养箱中28 ℃培养36～48 h，结果无细菌生长，说明灭活完全。

2.3 免疫原油佐剂灭活疫苗动物安全性检测结果免疫原油佐剂灭活疫苗分别灌服、肌注ICR雌性小鼠，经72 h临床观察，实验小鼠和对照小鼠无差别，剖检内脏器官未见任何变化，判为安全。

2.4IgY提取结果分别在初免后，收集第7 d、第14 d、第28 d的IgY，经硫酸铵溶液分级盐析、透析后，经12% SDS-PAGE电泳分离，结果显示初步提纯后的IgY有2条蛋白条带，即60 ku左右的重链，25～30 ku的轻链(见图2)。

2.5 间接ELISA方法的确立

2.5.1抗原及一抗工作浓度的筛选结果：由表1可见，抗原包被浓度为1∶ 100，抗体稀释度为1∶ 512时，D450 nm值接近1，且P/N值较大。

2.5.2酶标二抗工作浓度的确定：由表2可见，酶标二抗在1∶ 4 000倍稀释，一抗在1∶ 512倍稀释时，D450 nm值接近1，且P/N较大。

图2 提取IgY的SDS-PAGE电泳M:标准Marker； 1:第28 d IgY； 2:第14 d IgY； 3:第7 d IgY

表1 抗原最佳包被浓度及一抗工作浓度的筛选

表2 一抗及酶标二抗工作浓度的确定

2.5.3试验条件的优化结果：经2%BSA封闭30 min，P值在1.000左右，且P/N较大。一抗和二抗平最佳反应时间分别为60 min和45 min。最佳显色时间为室温20 min。见表3、表4、表5。

表3 封闭时间的确定

表4 一抗和二抗最佳反应时间的筛选

表5 最佳显色时间的确定

2.6间接ELISA的敏感性检测结果：本实验设计了5个浓度梯度的柱状黄杆菌包被液抗原，根据建立的间接ELISA最佳反应条件下测定各浓度菌液抗原的反应。结果检测出所制备的IgY对柱状黄杆菌的纯培养液的检出限值为1×107cfu/mL。见表6。

表6 间接ELISA的敏感性试验

2.7间接ELISA的特异性检测结果：用建立的间接ELISA方法检测柱状黄杆菌及常见的淡水鱼致病菌嗜水气单胞菌、哈维氏菌。结果柱状黄杆菌呈明显阳性反应，嗜水气单胞菌、哈维氏菌均呈阴性反应，说明本方法对柱状黄杆菌具有明显的检测特异性，对检测的其他菌株无交叉反应。见表7。

表7 间接ELISA的特异性试验

2.8重复性试验结果：经统计学分析，随机采集的5份IgY分别经同一批次和不同批次制备的酶标板检测，结果变异系数均小于10%，表明其反应的重复性好。见表8。

表8 间接ELISA的批内、批间重复试验

3 结论与讨论

3.1柱状黄杆菌是草鱼等鱼类烂鳃病的病原，全球每年由于感染这些致病菌引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重。目前各类抗生素药物常被用于控制致病菌引起的疾病，然而化学药物容易导致病原菌的耐药性增强和药物残留，影响水产品安全且可能导致水环境受污染[9]。本研究从患典型烂鳃病草鱼烂鳃中分离到1株细菌，经生化检测鉴定为柱状黄杆菌(FC-3株)，攻毒试验表明其具有致病性。

3.2IgY的制备及应用是近年来迅速发展的技术，因其具有特异性、针对性、无耐药性、安全、制备简单且无残留等优点，已成为水产免疫学研究的热点。本研究采用0.4%甲醛灭活处理分离的柱状黄杆菌制备安全油佐剂灭活疫苗，经免疫健康120日龄桃源蛋鸡，制备柱状黄杆菌卵黄抗体IgY。经硫酸铵分级初步纯化，12% SDS-PAGE电泳分离初步提纯后的IgY，可见主要有2条蛋白条带，即60 ku左右的重链，25～30 ku的轻链。另外，电泳后还有1条电泳条带。说明通过全菌抗原免疫所得的IgY为多克隆抗体，是多种结构略有差异的抗体组分混合物，所以会出现除IgY的重链和轻链以外的不止1条电泳条带的结果。

3.3ELISA实验的关键在于抗原与抗体的结合，在反应过程中影响实验的因素较多，抗原抗体的浓度、温度及底物的作用时间等都直接影响到ELISA方法的准确性和可靠性。本研究在建立柱状黄杆菌间接ELISA检测方法过程中，通过对试验反应条件的优化，以阳性孔吸光值D450 nm接近1，且P/N值较大时为反应最佳条件，依据此标准测定了抗原稀释到1∶100，抗体稀释度为1∶ 512时，P/N值最大。辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY最佳工作浓度为1∶ 4 000。一抗、二抗最佳反应时间分别为60 min和45 min，显色最佳时间为室温20 min。测定柱状黄杆菌纯培养液的检出限值为107cfu/mL。此方法特异性高，仅与柱状黄杆菌发生特异性反应，不与其他淡水鱼病原菌株发生交叉反应，重复性好，可用于对柱状黄杆菌特异性抗体IgY的监测。