PK结肠溶胶囊对犬结肠炎的疗效评价

2019-07-23

贵州畜牧兽医 2019年3期

(贵阳市南明区动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 550002)

消化系统疾病是犬的多发病，其中犬结肠炎多因细菌感染、化学刺激、应激反应、结肠黏膜机械性损伤、过食、食物过敏或不耐受等原因造成[1，2]。溃疡性结肠炎(UC)以结肠的弥漫性黏膜炎症和溃疡性病变为特点，出现腹泻、便血、黏液增多和腹痛等症状，并且缓解与发作相互交替[3]。PK结肠溶胶囊是大理大学昆虫生物医药研究院新开发的1种药品，主要特点为胶囊在结肠内溶解，直接作用于患处。本试验制作犬的急性溃疡性结肠炎模型，综合评价口服PK结肠溶胶囊的疗效，为犬结肠炎的治疗探索更安全有效的治疗药物及疗效判断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物：健康中华田园犬成年犬16只，体重10～15 kg，雌雄各半。

1.1.2饲养管理：试验犬在同一栋标准化圈舍内单笼饲养，逐头称重并佩戴耳标建立档案，饲喂相同分量的日粮及水，预饲2周后注射犬英特威宠必威@优免康四联苗(犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、副流感，批号：A507A01)，再次确定健康后进入正式试验。

1.1.3药品试剂与实验仪器：(1)药品试剂：PK结肠溶胶囊(大理大学昆虫生物医药研究院惠赠)、淀粉结肠溶胶囊、柳氮磺吡啶结肠溶胶囊、淀粉、乙酸、生理盐水、复方新洁尔灭消毒液、犬眠宝、75%医用酒精、碘酒、EDTA、10%MgSO4。(2)仪器用品：全自动动物血细胞分析仪(Exigo，瑞典，SN-61564)、9215电子内窥镜、爱德士生化分析仪(IDEXX Vet Test，美国，OK51015)、C-反应蛋白测量仪(USHIO INC Point-reader V，日本，AMD02A)、生物显微镜、常规手术器械及用品、烧杯、量杯、弹簧度盘秤、载玻片、盖玻片。

1.2 方法

1.2.1分组：试验犬随机分为4组(每组4只，雌雄各半)，即阴性药物组(淀粉结肠溶胶囊1颗/kg)、正常剂量组(PK结肠溶胶囊1颗/kg)、 2倍剂量组(PK结肠溶胶囊2颗/kg)、阳性药物组(柳氮磺吡啶结肠溶胶囊1颗/kg)。

1.2.2制备动物模型：在造模前 1 d，使用10%MgSO4溶液按照 5 mL/kg体重对所有试验犬灌肠后，禁食不禁水24 h。造模当日，使用犬眠宝按照 0.15 mL/kg体重对所有实验犬肌肉注射进行全身麻醉后，参照乙酸诱导溃疡性结肠炎大鼠实验制备动物模型方法[4]，用聚乙烯导管自肛门伸入犬结肠 20 cm，缓慢注入7%乙酸溶液灌肠，保持犬头低尾高的姿态 15 s，用生理盐水 50 mL冲洗使乙酸溶液排出。

1.2.3分组给药：造模后第 1 d，将空腹试验犬头部抬高并打开口腔，对准舌根部喂服各试验药物。阴性药物组喂服淀粉结肠溶胶囊 1 颗/kg，正常剂量组喂服PK结肠溶胶囊 1颗/kg，2 倍剂量组喂服PK结肠溶胶囊 2 颗/kg，阳性药物组喂服柳氮磺吡啶结肠溶胶囊 1 颗/kg。

1.3 实验室指标测定

1.3.1血样采集：采血前向集血容器中加入适量EDTA抗凝剂，采集颈静脉血2 mL，冰箱4 ℃保存，送检过程避免血样剧烈震荡。

1.3.2白细胞总数检测：使用Exigo全自动动物血细胞分析仪检测各组给药后第 1 d、第 4 d、第 7 d 血样的白细胞总数(WBC)。

1.3.3C-反应蛋白检测：用USHIO INC Point-reader V(C-反应蛋白测量仪)检测各组给药后第 1 d、第4 d、第 7 d 血样的血清CRP含量。

1.3.4内窥镜检查：用内窥镜在造模前、造模后及给药后第 1 d、第 4 d、第7 d对试验犬结肠进行观察，记录结肠黏膜溃疡、溃烂和出血等情况。

2 结果

2.1 制备动物模型实验结果内窥镜观察可见：造模前犬结肠黏膜呈粉红色，黏膜表面光滑，无病变。造模后犬结肠黏膜充血、水肿，有炎性弥漫性浸润，肠壁凸凹不平，形成溃疡面，说明动物模型制备成功。

2.2 实验室指标测定结果

2.2.1WBC检测结果：(1)阴性药物组给药后第1 d，WBC为(23.825±3.113)×109/L；第 4 d为(24.275±4.182)×109/L；第7 d为(21.075±3.004)×109/L。(2)阳性药物组给药后第 1 d，WBC为(23.805±13.831)×109/L；第 4 d为(16.800±4.645)×109/L，恢复到正常范围(6×109/L～17×109/L)，较正常剂量组差异显著(P<0.05)；第 7 d为(13.550±2.767)×109/L。(3)正常剂量组给药后第 1 d，WBC为(24.275±4.920)×109/L；第 4 d 为(21.823±7.889)×109/L；第7 d 为(18.050±0.893)×109/L。(4)2倍剂量组给药后第 1 d，WBC为(25.000±12.884)×109/L；第 4 d为(11.250±5.540)×109/L，恢复到正常范围，较正常剂量组差异显著(P<0.05)；第 7 d为(10.600±2.688)×109/L，较正常剂量组、阳性药物组差异极显著(P<0.01)。见表1、图1。血常规检测WBC变化实验结果经统计学分析后，根据是否存在差异显著性，可反映药物是否成功治疗溃疡性结肠炎动物模型的临床意义。结果表明：2倍剂量PK结肠溶胶囊效果最好。

表1 犬WBC检测结果 ×109/L

注：各组间肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同

图1 犬WBC检测柱形图

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，无标注表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2.2CRP检测结果：(1)阴性药物组给药后第1 d，CRP为(103.775±16.747)mg/L；第4 d 为(97.600±29.676)mg/L；第7 d为(36.425±8.764)mg/L。(2)阳性药物组给药后第 1 d，CRP为(99.125±23.367)mg/L；第4 d 为(67.450±41.758)mg/L；第7 d为(14.500±2.783)mg/L。(3)正常剂量组给药后第1 d，CRP为(93.575±17.547)mg/L；第4 d 为(60.125±18.164)mg/L；第7 d为(18.450±7.303)mg/L。(4)2 倍剂量组给药后第 1 d，CRP为(103.675±28.430)mg/L；第4 d为(48.150±19.549)mg/L，较正常剂量组、阳性药物组差异显著(P<0.05)；第 7 d为(7.975±2.425)mg/L，恢复到正常范围(1～10 mg/L)，较正常剂量组差异显著(P<0.05)。见表2、图2。CRP的检测结果对药物治疗犬结肠炎疗效的观察具有临床意义。CRP在乙酸诱导急性溃疡性结肠炎发生时明显增加，在给药后第4 d、第7 d 随炎症消退而迅速下降。结果表明： 2倍剂量PK结肠溶胶囊效果最好。

表2 犬CRP检测结果 mg/L

图2 犬CRP检测柱形图

2.3WBC、CRP相关性分析结果各组相关方程式参考价值从高到低排序为：正常剂量组(r=0.998 2)>阴性药物组(r=0.977 3)>阳性组(r=0.938 5)>2倍剂量组(r=0.924 4)。相关系数r的大小决定了WBC、CRP 2个变量相关的密切程度，当r越接近1时，表示相关的方程式参考价值越高。结果表明：各组WBC和CRP呈正相关，均可作为犬结肠炎存在、严重程度、抗炎治疗效果的非特异性指标。

2.4 内窥镜观察结果

2.4.1给药后第 1 d：阴性药物组(见图3a)结肠黏膜出血、弥漫性充血、色泽鲜红；阳性药物组(见图3b)结肠黏膜屏障受损，组织细胞坏死导致黏膜面变粗糙；正常剂量组(见图3c)结肠黏膜上形成点状糜烂和多发性小溃疡；2倍剂量组(见图3d)结肠黏膜局部可见浆液弥漫性浸润。表明给药后第 1 d，4组实验犬疗效均不明显。

2.4.2给药后第 4 d：阴性药物组(见图4a)结肠黏膜水肿和充血依然可见，溃疡灶边缘体积基本没有减小迹象；阳性药物组(见图4b)结肠黏膜组织细胞粗糙、坏死，边缘体积减小；正常剂量组(见图4c)结肠黏膜水肿缓解，点状糜烂肠黏膜开始愈合；2 倍剂量组(见图4d)结肠黏膜局部渗出液体成分被肠黏膜吸收，溃疡面积和程度大幅减轻，但炎灶瘢痕边缘分界仍明显可见。表明给药后第 4 d，4组实验犬疗效最好的是2倍剂量组，正常剂量组和阳性药物组肠黏膜愈合程度大体一致。

a.阴性药物组 b.阳性药物组 c.正常剂量组 d.2倍剂量组图3 给药后第1 d结肠内窥镜检查结果

a.阴性药物组 b.阳性药物组 c.正常剂量组 d.2倍剂量组图4 给药后第4 d结肠内窥镜检查结果

2.4.3给药后第 7 d：阴性药物组(见图5a)结肠黏膜出血水肿情况有所减轻；阳性药物组(见图5b)及正常剂量组(见图5c)结肠黏膜糜烂和溃疡灶已经完成组织细胞修复，依稀可见留下的痕迹；2倍剂量组(见图5d)结肠黏膜色泽基本恢复正常，肉眼观察无明显病灶。表明给药后第7 d，4组实验犬疗效最好的是2倍剂量组，正常剂量组略好于阳性药物组。

a.阴性药物组 b.阳性药物组 c.正常剂量组 d.2倍剂量组图5 给药后第7 d结肠内窥镜检查结果

3 讨论

3.1 乙酸致犬溃疡性结肠炎模型的制备本实验参考肠腔灌注法制作乙酸致犬急性溃疡性结肠炎动物模型，是目前实验性UC模型中应用最广泛的模型之一，遵循了模型容易制备并且可以重复以及模型在病理上能反映疾病两大要点。由于乙酸溶液的化学刺激，作为病理学致炎因子引起炎性充血和刺激性充血，发生充血的肠黏膜色泽鲜红，炎灶边缘体积轻度增大。因小血管壁的通透性增高，炎灶内的微量液体成分通过血管基底膜缓慢渗出在肠黏膜上或者弥漫性浸润于肠黏膜上，可见浆液，局部炎性水肿并发生肠黏膜屏障受损、组织细胞坏死，形成溃疡面。参考夏冰等[5]的研究，前期准备实验中曾经试用4%、7%、10%乙酸溶液等不同浓度的实验试剂造模，从肠内壁黏膜损伤情况是否容易观察、能否有效指向研究目的等方面考虑，最终选择7%乙酸溶液制备结肠炎临床病例模型后，由胃肠镜从肛门深入结肠，发现结肠炎症程度随乙酸浓度增加而加重，而7%乙酸溶液既可导致犬结肠炎，又不致炎症太重，前期试验结果符合夏冰等提出的最佳致炎浓度4%～8%的结论。

3.2CRP与犬的急性溃疡性结肠炎C-反应蛋白(C-reactive protein ，CRP)是1930年由Tillett首先在急性大叶性肺炎患者血清中所发现的1种蛋白质，它在Ca2+存在下，同肺炎链球菌细胞壁上的 C多糖能饱和地结合在一起，发生沉淀反应，故命名CRP。CRP是急性炎症或组织严重损伤时出现的1种异常蛋白质，在急性炎症时数小时内明显增加，1～3 d可达到最高值(增加100～3 000倍)，故又称为“急性期蛋白”。本实验取犬颈静脉血，用C-反应蛋白测量仪分别检查给药后第1 d、第4 d、第7 d采集血样的血清CRP含量，结果表明：阴性药物组、正常剂量组、2倍剂量组、阳性药物组CRP在乙酸诱导急性溃疡性结肠炎发生时明显增加，在给药后第4 d及第7 d随炎症消退而迅速下降。在给药后第1 d、第4 d、第7 d分别以内窥镜观察肠道炎症的范围与程度，记录炎症发生后肠黏膜溃疡的整个愈合过程，除阴性药物组外，其他3组实验犬急性溃疡性结肠炎疾病经过的内窥镜观察结果和实验室检测血清中CRP数据变化情况一致。CRP检测结果快，操作更简单，实验数据真实可靠，能真实反映犬结肠炎临床症状的变化。CRP的检测已经在人医的临床广泛应用，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断、手术后感染的监测、抗生素疗效的观察、病程检测及预后判断等[6]。故认为本实验中CRP结果可以作为犬结肠炎存在、严重程度、抗炎治疗效果的非特异性指标之一。

3.3 内窥镜对犬结肠炎临床诊断的临床意义结肠镜的适应症包括：原因不明的便血或者粪潜血阳性；临床疑为结肠肿瘤；结肠疑有息肉，或者X射线检测发现息肉需要鉴别良性或恶性者；各种原因的腹泻、疑有溃疡性结肠炎、克罗恩病或者慢性痢疾，慢性结肠炎者；结肠手术后的复查及术前确定病变范围者。只要临床出现便血或者粪潜血阳性而原因不明时，就是结肠镜检查的适应症[7]。2012年广州炎症性肠病诊断与治疗的共识意见正式明确了结肠镜检查并活检是溃疡性结肠炎诊断的主要依据[8]。由于犬溃疡性结肠炎的症状主要发生在黏膜当中的弥漫性黏膜炎症和溃疡性病变，最主要的症状包括腹泻、结肠直肠出血、黏液增多和腹痛。对犬的结肠炎临床诊断时，利用内窥镜从肛门深入结肠即可直接观察到结肠黏膜表面的组织变化。本实验是否成功建立乙酸诱导溃疡性结肠炎临床动物模型病例、口服给药后各组实验犬结肠黏膜的愈合情况以及对PK结肠溶胶囊治疗犬结肠炎的疗效评价都与内窥镜观察结果密切相关，且在实验过程中能通过内窥镜对病变部位取活检病理学检查，对于提高动物临床确诊率具有很大的意义。

3.4PK结肠溶胶囊治疗犬结肠炎的疗效

3.4.1造模给药后第4 d内窥镜观察：2倍剂量组肠炎灶内渗出的液体成分被肠黏膜吸收，溃疡面积和程度大幅减轻，但炎灶瘢痕边缘分界仍明显可见。通过血常规检查：2倍剂量组WBC恢复到正常范围，较正常剂量组差异显著(P<0.05)；CRP下降幅度为53.56%，较正常剂量组、阳性药物组差异显著(P<0.05)。说明对于犬结肠炎的临床治疗，PK结肠溶胶囊2倍剂量组治疗效果更优于正常剂量组。

3.4.2造模给药后第7 d内窥镜观察：2倍剂量组结肠黏膜已恢复到动物健康时粉色带正常光泽。血常规检查：2 倍剂量组WBC恢复正常，较正常剂量组、阳性药物组差异极显著(P<0.01)；CRP也恢复到正常范围，较正常剂量组差异显著(P<0.05)，而阳性药物组CRP尚未恢复正常。说明PK结肠溶胶囊治疗犬急性溃疡性结肠炎效果优于柳氮磺吡啶结肠溶胶囊。