沙棘葡萄复配果酒的生产工艺优化

米兰，蒋玉梅，李霁昕，赵毓璇，布鑫荣，毕阳，韩舜愈

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省葡萄酒产业技术研发中心，甘肃兰州 730070；3甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科酸刺属的灌木或小乔木，别名黑刺、酸刺[1].为药食同源性植物[2].含有丰富的黄酮、多酚、维生素、矿物质[3]及其他活性成分[4]，具有非常高的营养价值及抗氧化性.但由于沙棘果中糖含量较低，一般无法发酵到国标所要求的果酒酒精度为8%以上的界限标准，同时沙棘中的有机酸含量过高也会影响酵母的正常生长代谢.因此在沙棘原浆中添加一定比例的酿酒葡萄汁，可以很好地补充发酵过程中由于糖量不足所造成的酒精度不高的缺陷，同时也可以适当稀释沙棘原浆中的有机酸含量，并且做出的复配酒与普通‘赤霞珠’葡萄酒相比多酚和有机酸等物质的含量均有升高[5-6]，同时又增加了‘赤霞珠’葡萄酒特有的香气颜色与高单宁的特点[9]，增加了产品的营养价值和附加经济价值.因此沙棘葡萄酒可以有效弥补两种物质各自的缺点，同时可以优点互补，在酿出具有丰富层次，饱满口感的复合酒的基础上，增加黄酮，维生素等营养物质的含量.

现今国内外对沙棘的应用主要集中在对其营养成分、生态价值、药用价值等领域[10]，而利用沙棘酿酒的研究多为通过单因素试验优化酿造工艺或后期调配酒的生产.如郭成宇等[11]以沙棘汁为原料，通过正交试验确定了干红沙棘果酒发酵的最佳工艺条件；田梦媛等[12]研究了果胶酶对沙棘葡萄酒的最佳酶解工艺条件；刘岩松等[13]分别用发酵法和浸泡法生产沙棘原酒，并以此为原料进行勾调酒的研发；牛广财等[14]对沙棘酒的主发酵条件进行了优化.在混合发酵方面，赵志永等[15]以沙棘和‘霞多丽’葡萄为原料发酵出沙棘葡萄酒并对其营养成分进行了检测；刘莹等[16]研究了沙棘汁与‘巨峰’葡萄混合酿制沙棘葡萄酒的最佳工艺条件.目前国外对沙棘的研究较多.但也仅局限于营养成分[17]，生态种植[18]及抗氧化能力[19]等方面.综上所述，国内外现有研究仅在正交试验的层面对沙棘与酿酒葡萄复配酒的酿造工艺进行了简单优化，并没有对其成分，特别是对沙棘原料中的特征性成分例如黄酮、总酸高的特点对酿造后的复合酒产生的影响进行研究.

本试验将沙棘汁与‘赤霞珠’葡萄汁混合进行发酵，一方面能明显改善沙棘酒单一的风味，中和其尖酸的口感；另一方面可使发酵而成的葡萄酒具有更高的VC和黄酮含量[20]，增加保健性[21].本试验研究了沙棘原浆与葡萄汁配比、酵母添加量、发酵天数与发酵温度4个因素对最终产品酒精度和黄酮含量的影响.在单因素试验的基础上，通过响应面试验进一步优化发酵条件，旨在保证产品具有较高酒精度的前提条件下最大限度的增加黄酮含量.与市售葡萄酒成分对比，沙棘葡萄酒具有更丰富的营养物质与风味物质.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘原浆由甘肃高原圣果华池沙棘开发有限公司提供，可溶性固形物为12.4 Brix；‘赤霞珠’葡萄由甘肃农业大学葡萄园提供；市售100%‘赤霞珠’葡萄酒.

CPJ214电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DK-8D电热恒温三孔水槽，上海森信试验仪器有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限司；沸点测定仪，上海光谱仪器有限公司；TD-45数字折射仪，上海精密仪器仪表有限公司；新锐T6紫外可见分光光度计，湖南湘仪离心机仪器有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 酒精度的测定 参见代秀芝[22]的方法，使用沸点测定仪测定.转动表盘，将表盘的“0”酒度刻度线与水沸点对齐，酒沸点所对应的外圈酒度值即为该葡萄酒的酒精含量.

1.2.2 黄酮的测定 参见钟方丽等[23]的方法.称量13.2 mg芦丁，用60%乙醇定容到25 mL容量瓶作为芦丁标准溶液.使用紫外可见分光光度计，以芦丁含量的浓度作为横坐标，一定浓度下所对应的吸光度作为纵坐标绘制标准曲线.根据标准曲线计算黄酮含量.

式中，A：吸光度；M：摩尔质量(g/mol).

1.2.3 多酚含量的测定 参见李浡等[24]的方法，使用酶提取法分别测定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中的多酚含量.

1.2.4 总酸含量的测定 参见贾柳军等[25]的方法，用近红外光谱分析技术对沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒发酵液中的总酸含量进行测定.

1.2.5 还原糖的测定 参见刘烨等[26]的方法，用直接滴定法测定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中的还原糖含量.

1.2.6 VC含量的测定 参见梁飞燕[27]的方法，采用2,6-二氯靛酚法测定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中VC的含量.

1.2.7 单因素试验设计

1.2.7.1 沙棘汁与葡萄汁配比对酒精和黄酮含量的影响 参照刘莹等[16]的方法，在发酵天数、酵母添加量、发酵温度分别为11 d、0.3 g/L、25 ℃的条件下固定不变，设置沙棘汁与葡萄汁的配比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5进行发酵，以成品酒精度与黄酮含量为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.7.2 酵母添加量对酒精和黄酮含量的影响 在发酵天数、发酵温度、沙棘汁与葡萄汁的配比分别为11 d、25 ℃、2∶8的条件下固定不变，设置酵母添加量分为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L进行发酵，以成品酒精度与黄酮含量为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.7.3 发酵温度对酒精和黄酮含量的影响 在发酵天数、沙棘汁与葡萄汁的配比、酵母添加量分别为11 d、2∶8、0.3 g/L的条件下固定不变，设置发酵温度分别为21、23、25、27、29 ℃进行发酵，以成品酒精度与黄酮含量为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.7.4 发酵天数对酒精和黄酮含量的影响 在沙棘汁与葡萄汁的配比、酵母添加量、发酵温度分别为2∶8、0.3 g/L、25 ℃的条件下固定不变，设置发酵天数分别为7、9、11、13、15 d进行发酵，以成品酒精度与黄酮含量为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.8 响应面试验设计 使用Design Expert 8.0软件，通过单因素试验确定响应面优化法试验的各因素水平.

表1 响应面分析因素及水平编码表

1.2.9 验证试验 为确保响应面优化条件的准确度，采用优化条件展开3次验证试验，按以下公式将试验得出的沙棘葡萄酒发酵后的酒精度和黄酮含量与理论值进行对比并计算相应误差.

1.2.10 沙棘葡萄酒与市售‘赤霞珠’葡萄酒的品质检测

1.2.10.1 理化指标检测方法 测定沙棘葡萄酒中的多酚、总酸、还原糖和VC含量，并与市售‘赤霞珠’单品种酿制的红葡萄酒中相应成分进行对比.

1.2.10.2 感官鉴定 组成10人品鉴小组，对沙棘葡萄酒与市售单品种‘赤霞珠’红葡萄酒的感官品质按照表2进行打分，评分结果利用Excel制作雷达图.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

沙棘葡萄酒的酒精度随着原料中沙棘汁所占比例的增加而逐渐降低(图1)，是因为随着原料中沙棘汁比例逐渐增加，原料中的总糖含量相应减少.酒精度由最初的9.5%下降到8.4%，降幅为11%.而黄酮含量随着原料中沙棘汁所占比例的增加而增加，由最初的18.65 mg/L，增加到最大值21.85 mg/L，增幅为1.2倍，是由于沙棘果中含有丰富的黄酮类物质，随着沙棘汁所占比例的增加，黄酮类物质的含量逐渐增加.

表2 葡萄酒评分细则表及感官要求(中国葡萄酒国家标准)

图1 配比对酒精度与黄酮含量的影响Figure 1 The influence of proportion of alcohol and ftavonoids content

图2 酵母添加量对酒精度与黄酮含量的影响Figure 2 The influence of yeast addition of alcohol and ftavonoids content

其他条件不变的情况下，沙棘葡萄酒中的酒精度和黄酮含量随着酵母添加量的增加有所提高但增幅不明显(图2).主要是因为产品中最终的酒精度是由原料中的总糖量决定的，酵母添加量只会影响酒精发酵的快慢，对酒精度的大小没有实质性的影响；而原料中的黄酮含量在确定了沙棘汁与葡萄汁的配比后也基本确定.发酵的过程中由于微生物的代谢会消耗一些黄酮类物质，但消耗量并不大[24].

其他条件不变，随着温度的升高，酒精度持续增加(图3)，由8.35%增加到9.515%，是由于随着温度的升高，酵母活性增强，转化糖的能力增强，当温度为29 ℃时，酒精度含量最高，达到了9.515%，增幅达到1.1倍.黄酮含量变化不明显，在25 ℃之后有所降低，是因为黄酮属于酚类物质，在25 ℃时提取最佳，后随温度的上升会对其化学结构产生影响，不易被提取出来，故随着温度的升高黄酮提取量稍有下降.在25 ℃时黄酮被最大的提取出来，达到21.09 mg/L，增幅为1倍.

图3 温度对酒精度与黄酮含量的影响Figure 3 The influence of temperature of alcohol and ftavonoids content

在其他条件不变的前提下，酒精度在第9天达到峰值(图4)，为9.93%，证明在发酵第9天时酿酒酵母对原料中的糖的转化量达到最大值，第9天之后沙棘葡萄酒的酒精含量基本保持不变，说明发酵体系中的糖基本已全部转化为酒精.而随着发酵天数的增加，复配酒中的黄酮含量逐渐增加，这是因为随着发酵时间延长，黄酮类物质的析出率在发酵过程中逐渐被提取出来，但由于主要的黄酮类物质含在果肉果皮中，故增幅并不明显.

2.2 响应面试验结果与分析

根据响应面Box-Behnken的要求，展开了17组试验，响应面分析见表3.

2.2.1 酒精度回归方程的建立及显著性检测 试验数据经统计分析回归处理后得到酒精度与4个变量的回归方程：

Y1=9.25-0.59X1+0.22X2-0.061X3-0.075X1X2-0.050X1X3+0.000X2X3-2.30X12-1.11X22-0.53X32

对该方程进行方差分析，结果见表4.

图4 发酵天数对酒精度与黄酮含量的影响Figure 4 The influence of fermentation days of alcohol and ftavonoids content

表3 试验设计与结果

表4 酒精度方差分析结果

***：差异极显著(P<0.001)；**：差异高度显著(P<0.01)；*：差异显著(P<0.05).

***：Very significant difference；**：Hightly significant difference；*：Significant difference.

由表4显著性分析可知，温度B及B2的P值均小于0.001，表明差异及显著，A、C及C2的P值均小于0.01，表明差异高度显著， AB、BC及B2的P值均小于0.05，表明差异显著.

由图5的响应面图可以看出，发酵天数与温度对酒精度影响显著.酒精度的最大值为9.38%.

图5 发酵天数与温度两因素交互作用对酒精度的影响Figure 5 Effects of interavtion between fermenting days and temperature on alcohol accuracy

2.2.2 黄酮含量回归方程的建立及显著性检测 试验数据经统计分析回归处理后得到黄酮含量与4个变量的回归方程：

Y2=20.98-0.57X1+0.23X2+0.074X3+0.050X1X2-0.12X1X3+0.23X2X3-2.05X12-1.05X22-0.61X32

对该方程进行方差分析，结果见表5.

表5 黄酮含量方差分析结果

***：差异极显著(P<0.001)；**：差异高度显著(P<0.01)；*：差异显著(P<0.05).

***：Very significant difference：**：Hightly significant difference；*：Significant difference.

由表5显著性分析可知，配比A、B、A2及B2的P值小于0.001，表明差异极显著， AB、BC、C2的P值均小于0.01，故差异高度显著，发酵天数C的P值小于0.05，表明差异显著.

由图6的响应面图可以看出，发酵天数与配比对黄酮含量有显著的影响，黄酮含量达到最大值22.47 mg/L.

2.2.3 验证试验 响应面优化得到的最佳工艺条件为：配比为2.18∶7.82，温度为25.63 ℃，发酵天数为11.06 d.为确保响应面优化条件的准确度采用优化条件展开了3次验证试验，为了方便实际操作，将配比取为2∶8，温度取为26℃，发酵天数取为11 d.试验得出发酵过程中酒精的平均度数为9.38%，相对误差4.2%，黄酮的平均含量为22.47 mg/L，相对误差为2.1%，因此响应面的设计所得的优化结果准确可靠，可解决实际问题.

图6 沙棘汁和葡萄汁配比和发酵天数两因素交互作用对黄酮含量的影响Figure 6 Effects of the interation between sebuckthorn juice and grape juice and fermentation days on the content of ftavonoids

2.3 沙棘葡萄酒与‘赤霞珠’葡萄酒的理化指标对比

由上图可以看出，沙棘葡萄酒的每一项理化指标均高于‘赤霞珠’葡萄酒，其中，以多酚和总酸含量升高的较为明显，具有更好的营养价值.

表6 理化指标对比

2.4 感官分析结果

经评分小组根据感官评价表对酒样的感官进行评价打分后得知，沙棘葡萄酒的色泽和澄清度并没有‘赤霞珠’葡萄酒好，但香气和滋味有一定的优势.这是因为沙棘果汁本身固形物含量较高，是一种浆状液体，很难澄清.由于沙棘原浆呈黄色，与葡萄汁混合发酵后制作出的沙棘葡萄酒呈现出砖红色，与赤霞珠葡萄酒的宝石红色相比，稍显逊色.在后续研究中对沙棘葡萄酒的色泽改良与澄清问题需进一步研究.

图7 感官评价Figure 7 Sensory evaluation

3 讨论

本试验利用单因素和响应面试验对沙棘葡萄混酿酒的发酵工艺进行了优化.沙棘原浆由于具有酸度高，黄酮含量高但糖度低的特点如不经过调配很难在短时间内发酵成酒精度符合标准并且口感适宜的果酒，现今大量的文献中对沙棘酒的制作大多集中在原料前期稀释加糖的方法.本试验利用酿酒葡萄‘赤霞珠’原汁与沙棘原浆复配作为原料进行发酵制备新型的复合果酒，对最终产品的主要代表性营养成分进行检测并与市售‘赤霞珠’葡萄酒进行对比后证明，沙棘葡萄酒中的多酚、总酸和VC的含量远远高于普通‘赤霞珠’葡萄酒，这是沙棘的产品特性决定的.同时，‘赤霞珠’为沙棘葡萄酒提供了可发酵至适宜酒精度的糖，极大丰富了产品的香气和口感.但是由于沙棘原浆的固形物含量偏高，并且类胡萝卜素的含量非常高，整体呈现橙黄色，造成发酵后沙棘葡萄酒的澄清工艺比普通葡萄酒的复杂，且产品最终呈现出砖红色的特点.这需要后续对发酵条件影响产品色调的规律进行进一步的研究.利用响应面优化可以比单一的单因素试验更精确地反映出沙棘葡萄复配酒的最佳酿造工艺，本试验选择产品酒精度与黄酮含量作为沙棘葡萄酒的品质判断指标，结合感官鉴定最终优化了沙棘葡萄酒的发酵工艺.同时也明确了各发酵条件对产品品质变化影响的相关性，为后续的试验提供了一定的参考价值.

4 结论

本试验利用单因素试验对沙棘葡萄混酿酒的沙棘汁与葡萄汁原料配比、发酵天数，酵母加入量，发酵温度4个指标进行了优化，在此基础上利用响应面试验研究了发酵温度、发酵天数和沙棘汁与葡萄汁配比3个参数对复合酒的酒精度和最终产品黄酮含量的互作规律.结果表明酵母添加量与发酵温度对整体发酵过程的持续时间有着显著的影响，而发酵天数与温度对酒精度影响显著.结合感官鉴定当产品中酒精度为9.38%时达到感官品质最优值.发酵天数与原料中葡萄汁与沙棘汁配比对最终产品黄酮含量有显著的影响，感官达到最优时产品黄酮含量达到最大值为22.47 mg/L.经过验证试验表明由响应面得到的最佳沙棘葡萄酒的发酵工艺条件为：沙棘汁与葡萄汁配比为2∶8，温度为26 ℃，发酵天数为11 d.在此条件下沙棘葡萄酒酒精度数为9.38%，黄酮的平均含量为22.47 mg/L.与理论相对误差分别是4.2%和2.1%，因此响应面的设计所得的优化结果准确可靠，可解决实际问题.将沙棘葡萄酒与市售‘赤霞珠’葡萄酒进行营养成分对比可知，沙棘葡萄酒中的多酚、总酸、还原糖和VC的含量均高于普通‘赤霞珠’葡萄酒，特别是多酚与总酸，分别高出14.06%和4.49%.利用沙棘汁与葡萄汁原料复配发酵生产的沙棘葡萄酒不仅能够得到优良的口感，还弥补了由沙棘单品种原料发酵酒时经常因糖度不足酸度过高，最终造成发酵时间延长、酒精度过低与酵母生长受抑制的缺陷；同时也比普通葡萄酒含有更多的黄酮、多酚和有机酸，营养价值得以提高.因此，沙棘葡萄酒的开发不仅丰富了果酒品种，更是充分了利用了西北特色原料沙棘，对其产品的深加工与地方产业经济的拉动具有实际意义.