扩散加权成像与光学成像评价小鼠胃癌移植瘤体内动态变化

孙佳，李晓婷，张来运，杨磊，李竹林

1.首都医科大学附属北京朝阳医院放射科，北京 100020；2.北京大学肿瘤医院放射科，北京 100142； *通讯作者 孙佳xnqiuqiu@163.com

胃癌的病死率居中国恶性肿瘤第2位，其在发展、转归过程中的生物学行为体现出癌肿的恶性度及侵袭性，反映了胃癌的本质，直接影响胃癌的预后[1-2]。MRI对软组织的分辨率高，可为胃癌生物学行为提供多种评价指标[3]。扩散加权成像（DWI）更能够从分子水平反映病变内部的结构，在形态学发生变化前即可通过表观扩散系数（ADC）量化水分子扩散的变化[4-6]。生物发光成像不仅可以定性反映肿瘤细胞的存在，利用光子数还可以敏感地定量分析瘤体内细胞活性的变化[7-9]。DWI-ADC与光字数均为胃癌生物学行为变化提供了新的早期评价指标。本研究联合 MRI与光学成像，通过对胃癌小鼠移植瘤进行体内动态观察，评价胃癌生物学行为的演变。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞培养与动物模型建立 采用低分化胃腺癌BGC-823细胞株，在RPMI 1640培养基中使用胎牛血清培养，培养温度（37.0±2.0）℃，pH 7.2，5% CO2。选择对数生长期的细胞制成PBS悬液。

雌性Balb/c裸小鼠5只，4～6周龄。将BGC-823细胞悬液200 µl注入小鼠右腋下皮下组织内，建立皮下移植瘤模型。

手术切除1只小鼠皮下瘤，选取肿瘤实性部分切成约1 mm3的组织块。选取正常雄性Balb/c裸小鼠5只，4～6周龄，取腹部左正中旁切口，将1 mm3组织块种植于胃前壁肌层，建立胃癌的原位移植瘤模型[10]。

1.2 MRI扫描与分析 荷瘤小鼠均行 GE Discovery MR750 3.0T MR基线扫描，使用8通道高清腕关节线圈。T1WI：TR 400 ms，TE 12 ms；T2WI：TR 3381 ms，TE 58 ms。轴位视野（FOV）60 mm×30 mm、冠矢状位FOV 60 mm×60 mm。DWI-EPI序列（b=0、1000 s/mm2）：TR 2000 ms，TE 75 ms，FOV 80 mm×60 mm。所有序列层厚均为2 mm。T2WI图像测量肿瘤面积，DWI图像测量肿瘤ADC值。由2名具有10年工作经验的放射科主治医师独立测量获得结果，并取平均值。感兴趣区勾画避开肿瘤坏死部分。

1.3 生物发光成像 通过阳离子脂质体法对 BGC-823细胞进行转染，至转染效率达95%以上。Xenogen IVIS光学成像系统，皮下移植瘤小鼠分别于移植后第5、9、13、17、21、25、28天进行光学成像，原位移植瘤小鼠分别于移植后第7、10、14、21、28、35、42天进行光学成像。荷瘤小鼠全部进行光学的基线观察，排除背景光影响。皮下移植瘤观察截止于移植后第4周，原位移植瘤观察截止于移植后第6周。

1.4 病理学切片染色 将小鼠移植瘤、胃、肝、脾、胰腺、双肾、小肠、结肠、后腹膜及肠系膜、双肺、大脑、小脑、胸椎、腰椎等标本进行HE染色，实质性器官间隔0.2 cm进行切割，石蜡包埋，切片厚度4 µm。判断移植瘤观察末期肿瘤内活性组织、坏死情况、肿瘤对邻近组织结构的侵袭性及转移情况。

2 结果

2.1 皮下移植瘤和原位移植瘤的大小、DWI-ADC值及光子计数动态变化 MRI皮下移植瘤截面积随时间不断增大，皮下移植瘤截面积-时间曲线斜率无明显变化（图 1A）；原位移植瘤的面积随时间不断增大，第 30天后肿瘤截面积-时间曲线出现平台（图1B）。

皮下移植瘤的ADC值先逐渐下降，于第 13天ADC值-时间曲线出现平台，然后反向上升（图1C）；原位移植瘤ADC值-时间曲线的变化相似，于第28天肿瘤ADC值出现平台，继而反向上升，但转折点的出现早于生物发光成像（图1D）。

皮下移植瘤与原位移植瘤的光子数-时间曲线随时间增加，光子数升高后出现下降。皮下移植瘤光子数-时间曲线的转折点出现于第17天（图1E）；而原位移植瘤的转折点出现于第35天（图1F）。

2.2 皮下移植瘤和原位移植瘤的生长方式与转移MRI胃癌小鼠皮下移植瘤始终呈膨胀性生长，边界清楚，无向下浸润。观察结束后切除皮下移植瘤，瘤体均具有完整的包膜，对邻近组织无浸润。5枚原位移植瘤早期边界清晰，接种第28天瘤体与邻近器官分界欠清，交界面凹凸不平，呈浸润性生长。观察结束切除原位移植瘤，瘤体与周围器官均粘连严重，连同邻近组织共同切除。各原位移植瘤转移情况见表1。

移植瘤的转移MRI中，结合轴位、冠状位、矢状位，皮下移植瘤与原位移植瘤小鼠均未见转移。在生物发光成像中，5只皮下移植瘤小鼠与5只原位移植瘤小鼠在移植瘤部位以外均未见发光。病理切片中，皮下移植瘤小鼠的各部位均未见转移。原位移植瘤小鼠肝、脾、胰腺、食管和结肠可见受侵，肠系膜及后腹膜内可见广泛脉管癌栓，各小鼠受累情况见表 1。但MRI与光学成像均未见显示。

图1 胃癌皮下移植瘤与原位移植瘤的截面积-时间、ADC值-时间及光子数-时间曲线。A、C、E为皮下移植瘤；B、D、F为原位移植瘤

表1 原位瘤累及深度及全身受累部位

3 讨论

通过动态观察得知，皮下移植瘤截面积-时间曲线与光子数-时间曲线的主要形态差别在于光子数曲线存在转折点（约第17天），与既往研究结果相似[11-12]，光子数在肿瘤生长早期与肿瘤负荷密切相关，后期两者相关性不再可靠。这是由于生物发光光学信息来源于细胞内部报告基因，决定了其高度特异性[7,13-14]。因此，光学信号的强弱可以评价肿瘤内活性细胞的变化[7-9]。早期肿瘤增殖活跃，瘤内以实质细胞为主，光学信号呈逐渐增强的趋势，肿瘤继续生长，细胞内间质逐渐增多，出现大量新生血管及纤维，并可见出血，而这些间质成分参与构成肿瘤的大小并不参与光学信号的发出[11]。同时，随着肿瘤进一步生长，造成血供不足，瘤内出现大量坏死，坏死组织并不能发出光学信号，以上因素共同导致随着肿瘤截面积的进一步增大，光学信号值却下降[15]。因此，与生物发光成像相比，MRI的截面积曲线可以更好地反映肿瘤的生长速度。但光子数的曲线特点却与ADC值曲线类似，均出现转折点。但ADC值-时间曲线的转折点出现得更早（约第9天），且于第13天出现平台，然后反向上升。ADC值反映了组织内水分子的扩散受限程度，由于扩散受限程度越大，ADC值越低，肿瘤生长早期异常增殖明显，扩散受限逐渐加重，故ADC值逐渐下降。随着肿瘤进一步生长，细胞质水分丧失，细胞间质中的胶原、基质肿胀、崩解和断裂均使水分子扩散受限得到缓解，ADC值停止继续下降，曲线出现转折点，生长末期细胞核出现浓缩、碎裂和溶解，坏死的细胞和崩解的间质融合液化，ADC值反向上升。ADC值-时间曲线转折点的出现早于光子数-时间曲线，提示肿瘤细胞在彻底失活前（光学信号消失前），其所处的微环境可能已经发生变化，ADC值能够更敏感地反映组织结构的变化，与既往研究结果相似[16-18]，肿瘤的生长动力曲线并不能很好地反映瘤内成分的变化；而ADC值则可以反映细胞的结构改变，是早期预测肿瘤坏死的敏感指标。DWI信号的变化可以反映病理下不同结构甚至分化程度。本研究结果发现，ADC值反映细胞结构变化的敏感性高于反映细胞活性的生物发光成像。

对于原位移植瘤，后期由于受生长空间限制，肿瘤生长曲线出现平台，曲线的转折点与原位移植瘤光子数曲线转折点出现的时间几乎相同，从而可以判断第35天原位移植瘤内成分出现变化，而这一变化在ADC值-时间曲线中于第28天即可显示。

T1WI、T2WI观察原位移植瘤在生长后期（第28天后）出现浸润性，而皮下移植瘤始终呈膨胀生长。既往研究发现，适宜的宿主环境是移植瘤克隆形成的必需条件[19-20]。受局部组织免疫反应的影响，皮下移植瘤周围易形成鼠源性纤维包膜[21]；而原位移植瘤模型由于细胞生长环境更接近实际情况，更有利于进行肿瘤侵袭和转移的相关研究[8]。本研究中胃癌原位移植瘤生长方式的变化可以更准确地反映恶性肿瘤的生物学行为，而MRI能够反映胃癌生长方式的变化。本实验中，MRI与光学成像均未发现转移。通过镜下观察发现癌栓长径约0.1～0.3 mm，且多位于小鼠体内较深部，截面内肿瘤细胞数约2×102个，故病灶体积较小、脉管内肿瘤细胞数量过少等因素致使脉管内微转移灶很难通过生物发光成像在体表被探及[22-23]。同时MR的体素大小也限制了转移灶在MRI中的显示。

由于本研究为肿瘤连续在体动态观察，故仅进行了终点时的影像-病理对照，对于肿瘤生长进程中的病理对照有待进一步展开工作探讨。

总之，MRI及光学成像可以评价胃癌生物学行为的演变。DWI-ADC与生物发光成像均可以早期提示肿瘤内活性成分的变化，且DWI-ADC的敏感性高于生物发光成像。