子二代中华鲟对急性低温胁迫的生理响应

管 敏，张德志，王 龙，班文波，张厚本，郭柏福，姜 伟

( 中国长江三峡集团有限公司 中华鲟研究所，三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443100 )

中华鲟(Acipensersinensis)为大型溯河产卵洄游性鱼类，属国家一级重点保护动物。作为变温动物，水温是影响中华鲟正常生长和代谢的重要环境因子之一。中华鲟的最适生长温度为14～23 ℃[1]，在其生活环境中，经常出现由季节更替、气候变化及人为因素等导致水温出现节律性或突发性的温度降低[2]，从而对其造成一定程度的低温胁迫。低温胁迫可以对鱼类的行为[3]、营养代谢[4]、血液指标[5-6]、抗氧化能力[7]、免疫[8-9]、消化能力[5]等产生影响。当低温胁迫的强度在鱼体耐受范围内时，机体会通过自我调节适应低温环境；当低温胁迫的强度超出鱼类承受能力时，鱼体内环境稳态将发生不可逆的改变，最终导致其死亡[10]。因此，研究急性低温胁迫对子二代中华鲟的影响对其物种保护具有非常重要的实际意义。

在中华鲟物种保护研究方面，国内学者做了大量工作。1983年，野生中华鲟的人工繁殖技术获得突破，并形成一定数量的子一代中华鲟群体[11]，并于2009年获得初具数量规模的子二代中华鲟群体[12]。子二代中华鲟与子一代存在较明显的种质差异，主要表现为生长慢[13]、抗逆性差和遗传多样性丢失[14]等。这与繁殖亲本不同性质的生活环境有关，子一代中华鲟亲本与野生亲本相比，其生存于纯淡水养殖环境中，无法进行江海洄游，缺少在海洋中生长育肥的阶段[13]。目前，环境胁迫对中华鲟影响研究的对象均为子一代中华鲟，主要集中在饥饿胁迫[15]、拥挤胁迫[15]、渐变温度胁迫[16-18]、氨氮和亚硝态氮的急性胁迫[19]等方面，而关于急性低温胁迫对子二代中华鲟抗氧化、免疫及消化能力影响的研究未见报道。笔者通过对子二代中华鲟进行急性低温胁迫，探究其抗氧化指标、免疫指标及消化酶活性对急性低温胁迫的响应，以期为子二代中华鲟的人工养殖、运输和放流提供重要的技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼为中国长江三峡集团公司中华鲟研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中华鲟。随机挑选规格一致、体质健康的子二代中华鲟27尾[体质量(1.72±0.33) kg，全长(74.40±5.80) cm]，并将其暂养于直径4.0 m的养殖池中，暂养水体温度23.0 ℃、溶解氧6.0～7.0 mg/L、pH 7.3～7.6、氨氮0.01 mg/L、亚硝态氮0.005 mg/L。每日饱食投喂1次(投喂量为鱼体质量1%)，暂养3 d后开始试验，试验开始前1 d停止投喂。

1.2 试验设计

试验在3个直径4.0 m、水深0.8 m的试验池中进行，试验池水温分别设置为23、17 ℃和11 ℃，其中，23 ℃组为常温对照组，17 ℃组和11 ℃组为低温胁迫组，每个温度组9尾鱼，设3个平行对照组。具体试验方法为：使用循环水系统的制冷机将试验池中的水温由23.0 ℃降至设定温度后，将试验鱼由23 ℃暂养水体中分别直接转至水温为17 ℃和11 ℃的试验池中，低温胁迫2 h后取样；23 ℃组作为常温对照组，也采取相同的人为操作方法将试验鱼由23 ℃暂养池中转至水温为23 ℃的试验池中，2 h后取样。在整个转鱼过程中，为了最大限度减少人为操作对试验鱼造成的应激反应，试验鱼的转移采用转运箱带水转移的方法。试验期间连续充气，每30 min校调一次温度，维持温差在±0.5 ℃。

1.3 样品采集和处理

采集27尾子二代中华鲟血液、肝脏、胃及肠道样品；每尾鱼取25～35 mL血液，采集18份肝脏组织、6份胃组织和6份肠道组织样品。取样前，用120 mg/L MS-222将鱼进行麻醉，然后抽血，离心后将上层血清分装于2 mL离心管中，经液氮快速冷冻后，-70 ℃保存待测。将试验鱼解剖，取肝脏、胃和肠道并经预冷的0.65%的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水后，切成约0.5 g的组织块，取3～4个组织块装于2 mL离心管中，每个离心管为1份样品，经液氮快速冷冻后，-70 ℃保存待测。

1.4 指标测定

抗氧化指标包括超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、总抗氧化能力活性、谷胱甘肽含量、丙二醛含量；免疫指标包括溶菌酶活性和免疫球蛋白M含量；消化酶指标包括淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶。所有指标的测定采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒。

1.5 数据统计

数据用SPSS 16.0和Excel 2016软件进行统计分析，利用单因素方差分析和Duncan′s多重比较检验低温胁迫对各项指标影响的显著性，以P<0.05为差异显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 急性低温胁迫对子二代中华鲟抗氧化指标的影响

急性低温胁迫2 h，虽未导致子二代中华鲟直接死亡，但对其抗氧化指标已产生显著影响(表1)。子二代中华鲟血清超氧化物歧化酶活性随水温骤降温差的增大呈先升后降的趋势，11 ℃组和17 ℃组差异显著(P<0.05)；血清过氧化氢酶活性显著降低(P<0.05)；血清总抗氧化能力活性显著增加，23 ℃组与17、11 ℃组差异显著(P<0.05)；各温度组血清谷胱甘肽和丙二醛含量均为11 ℃组>23 ℃组>17 ℃组(P>0.05)。

表1 急性低温胁迫对子二代中华鲟血清抗氧化指标的影响

注：不同字母表示不同温度组之间差异显著(P<0.05)，下同.

子二代中华鲟肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和总抗氧化能力活性随水温骤降温差的增大呈先升后降的趋势(表2)。其中，11 ℃组肝脏超氧化物歧化酶活性与17、23 ℃组差异显著(P<0.05)，17 ℃组肝脏过氧化氢酶活性与11、23 ℃组均差异显著(P<0.05)，各组肝脏总抗氧化能力活性差异不显著(P>0.05)；肝脏谷胱甘肽含量显著下降(P<0.05)，而肝脏丙二醛含量显著增加(P<0.05)。

2.2 急性低温胁迫对子二代中华鲟免疫指标的影响

随着水温骤降幅度的增大，血清和肝脏溶菌酶活性均呈先升后降的趋势(图1)，其中，各温度组血清溶菌酶活性差异显著(P<0.05)，17 ℃组肝脏溶菌酶活性显著高于11 ℃组和23 ℃组(P<0.05)。

表2 急性低温胁迫对子二代中华鲟肝脏抗氧化指标的影响

随着水温骤降温差的增大，子二代中华鲟血清和肝脏的免疫球蛋白M含量均呈逐渐递减的趋势，但各组间差异不显著(P>0.05)(图2)。

2.3 急性低温胁迫对子二代中华鲟消化酶活性的影响

急性低温胁迫2 h，对子二代中华鲟消化酶活性产生显著影响。随着水温骤降温差的增大，子二代中华鲟胃淀粉酶、肠淀粉酶和肝脏淀粉酶活性持续下降(图3)，且23 ℃组胃淀粉酶、肠淀粉酶和肝脏淀粉酶活性与11 ℃组均差异显著(P<0.05)。在同一水温组中，肠淀粉酶活性显著低于胃淀粉酶和肝脏淀粉酶活性(P<0.05)。

图1 急性低温胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏溶菌酶活性的影响不同字母代表中不同温度组之间差异显著(P<0.05),下同.图2 急性低温胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏免疫球蛋白M含量的影响

图3 急性低温胁迫对子二代中华鲟淀粉酶活性的影响不同小写字母表示相同组织不同温度组之间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示相同温度不同组织之间差异显著(P<0.05)，下同.

子二代中华鲟肝脏脂肪酶活性显著高于胃、肠(P<0.05)(图4)。水温骤降显著提高胃和肝脏的脂肪酶活性(P<0.05)，但对肠脂肪酶活性影响不显著(P>0.05)。

图4 急性低温胁迫对子二代中华鲟脂肪酶活性的影响

子二代中华鲟胃组织的胃蛋白酶活性显著高于肠道和肝脏(P<0.05)(图5)。由此可见，在比较急性低温胁迫对鱼体胃蛋白酶活性影响时，可忽略肝脏和肠道中的胃蛋白酶，直接选用胃组织中胃蛋白酶的活性变化来代表鱼体胃蛋白酶的活性变化。本试验中，水温骤降2 h显著降低了鱼体胃蛋白酶的活性(P<0.05)，且胃蛋白酶的活性随水温骤降幅度的增大呈先降后升的趋势(P<0.05)，但11 ℃组胃蛋白酶活性仍显著低于23 ℃组(P<0.05)。

图5 急性低温胁迫对子二代中华鲟胃蛋白酶活性的影响

3 讨 论

3.1 急性低温胁迫对子二代中华鲟抗氧化能力指标的影响

生物体内存在可清除过多活性氧自由基的抗氧化防御体系，主要包括抗氧化酶系统和非酶促系统，其中，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶就是抗氧化防御体系中非常重要的功能酶[20]，二者相互关联，可联合清除活性氧自由基，其活性的下降标志着机体清除活性氧自由基的能力下降[21]。本研究中，随着水温骤降温差的增大，子二代中华鲟血清、肝脏的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均出现先升后降的趋势，这与银鲳(Pampusargenteus)幼鱼[22]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)幼鱼[23]的研究结果相同。这表明，当水温由23 ℃骤降至17 ℃时，鱼体可以通过提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性来应对低温应激反应的影响；但当骤降温差增至12 ℃时，11 ℃组血清和肝脏的超氧化物歧化酶活性显著低于17 ℃组，说明12 ℃的骤降温差已对鱼体内抗氧化酶活性产生显著的抑制作用，而刘奇奇[24]分析认为，这不仅与酶活力下降有关，还与温度骤降导致酶合成途径受阻有关。

谷胱甘肽是一种低分子活性氧自由基清除剂[25]，是清除活性氧自由基非常重要的非酶抗氧化物质[26]。本试验中，子二代中华鲟肝脏谷胱甘肽含量随水温骤降温差的增大呈先降后升的趋势，这与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性变化趋势相反，推测其原因为谷胱甘肽是谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶分解过氧化氢所必需的底物[26]，水温骤降直接影响谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶活性，从而间接影响谷胱甘肽的含量。银鲳幼鱼[22]的研究结果证实了这一推测，当温度自27 ℃骤降至22 ℃时，银鲳幼鱼肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性在0～12 h内显著下降。

总抗氧化能力的大小是衡量机体抗氧化系统功能的综合性指标，它可以反映机体抗氧化防御系统应对外来胁迫的能力[27]。冯广朋等[17]研究发现，在水温恒定的条件下，20 ℃组子一代中华鲟幼鱼总抗氧化能力活性高于15 ℃组、25 ℃组和30 ℃组，分析认为，由于鱼类在低温和高温条件下，机体内活性氧自由基增多导致防御体系的抗氧化物质不断减少引起的。本研究中，水温骤降显著增加子二代中华鲟血清总抗氧化能力活性，说明鱼体针对低温胁迫已开启自我保护机制；11 ℃组中血清总抗氧化能力显著高于23 ℃组(P<0.05)，这可能是因为当鱼体抗氧化酶促反应体系受抑制时，非酶促反应体系(如氨基酸、维生素、金属蛋白质等)应对应激反应的的结果。此外，11 ℃组肝脏总抗氧化能力含量与其他两组相比不升反降，这与四指马鲅(Eleutheronematetradactylum)幼鱼[24]在水温骤降12 ℃胁迫2 h时的结果相同。

丙二醛是活性氧自由基与脂质发生过氧化反应的产物，它可以反映细胞受活性氧自由基攻击的程度，从而间接反映机体抗氧化能力的强弱及组织细胞受损伤的严重程度[22,25]。试验结果表明，子二代中华鲟血清丙二醛含量随水温骤降幅度的增大呈先降后升的趋势，但各组之间差异不显著(P>0.05)；而肝脏丙二醛含量随骤降温差的增大而急剧增加(P<0.05)，分析认为急性低温胁迫造成鱼体产生大量活性氧自由基，抗氧化系统在短时间内无法清除过量的活性氧自由基，使得活性氧自由基不断攻击肝脏细胞产生大量丙二醛，这间接反映了急性低温胁迫对子二代中华鲟的肝脏造成了一定程度的损伤。这与四指马鲅幼鱼的研究结果相同[24]，即当水温由27 ℃骤降至15 ℃并胁迫2 h时，其肝脏已受到较为严重的损伤，具体表现为肝细胞空泡化、肝板结构混乱、肝血窦间隙收缩及肝细胞整体染色加深。

3.2 急性低温胁迫对子二代中华鲟免疫指标的影响

溶菌酶是鱼体非常重要的免疫因子，其活性与水温、盐度、细菌等环境因子密切相关[28]。在急性应激条件下，鱼体血清中溶菌酶活性会显著增加[29]。本研究中，子二代中华鲟血清、肝脏的溶菌酶活性随水温骤降幅度增大均呈先升后降的趋势，即当水温由23 ℃骤降至17 ℃时，子二代中华鲟血清、肝脏溶菌酶活性增加，说明鱼体通过提高溶菌酶活性来增强自身非特异免疫的能力，以应对低温骤降带来的不利影响，这与孙学亮等[30]的报道结果类似；但当水温由23 ℃骤降至11 ℃时，血清、肝脏溶菌酶活性与17 ℃组相比显著下降，这表明，温差达12 ℃显著降低了鱼体溶菌酶活性，对机体的免疫功能产生了显著的抑制作用。这与Fevolden等[31]认为的胁迫强度和方法可以影响溶菌酶活性变化的观点一致。

免疫球蛋白M是鱼体内一种重要的免疫球蛋白[29]，其含量的多少是评价鱼体免疫应答反应的一项重要指标[22]。本研究中，子二代中华鲟血清和肝脏免疫球蛋白M含量随水温骤降温差的增大均呈现递减的趋势(P>0.05)，这与低温胁迫对银鲳幼鱼[22]、莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)[29]的血清免疫球蛋白M影响结果基本相同，说明温度的骤降抑制了免疫球蛋白M的产生，降低了鱼体的免疫力。

3.3 急性低温胁迫对子二代中华鲟消化酶活性的影响

鱼类作为变温动物，水温骤变将直接影响其体内消化酶的活性[32]。研究发现，在一定温度范围内，温度逐渐升高会增加奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)(22～34 ℃)[33]、鼠龙斑(Cromileptesaltivelis♀×Epinepheluslanceolatus♂)幼鱼(26～33 ℃)[7]的消化酶活性，但温度急降会对鼠龙斑的消化酶活性产生抑制作用[7]。本研究结果显示，随着水温骤降温差的增大，子二代中华鲟胃、肠和肝脏淀粉酶活性均不断下降，这与宾石玉等[34]研究结果相一致，即低温胁迫会显著降低罗非鱼体内淀粉酶的活性。试验结果还表明，水温骤降显著提高了胃和肝脏的脂肪酶活性，其原因可能为鱼体通过提高脂肪酶活性加速体内脂肪的降解，从而为鱼体在短时间内提供更多能量以应对低温胁迫带来的不利影响，这与何杰等[29]的研究结论基本相符。

施兆鸿等[5]研究认为，急性低温胁迫对银鲳幼鱼胃蛋白酶活性在48 h内无显著影响，这与本试验结果不同。本研究中，急性低温胁迫显著降低了鱼体的胃蛋白酶活性，其原因可能为水温骤降引起鱼体消化系统的代谢强度降低，从而导致消化酶活性和基础分泌量的降低，在神仙鱼(Pterophyllumscalare)[35]和真鲷(Pagrosomusmajor)幼鱼[36]的研究中得到类似的结果。研究结果还表明，11 ℃组的胃蛋白酶活性显著高于17 ℃组，其原因可能为，当水温骤降温差为6 ℃时，鱼体通过消耗糖原、脂肪等物质就可以满足机体应对应激的能量需求，而当骤降温差增至12 ℃时，消耗糖原、脂肪等物质已经不能满足鱼体需求，机体已经开始消耗部分蛋白质来加大能量供应。

研究发现，当水温由27 ℃骤降至20 ℃和15 ℃，并胁迫2 h时，四指马鲅幼鱼的死亡率分别为23.33%和50%[24]。而本研究中，急性低温胁迫2 h虽未导致子二代中华鲟直接死亡，但对其抗氧化、免疫和消化酶活性影响显著。子二代中华鲟在水温骤降时，试图通过提高自身抗氧化能力消除体内过多的活性氧自由基，增强免疫能力以避免鱼体受感染，并主动调节脂肪酶、蛋白酶等消化酶的活性为鱼体应对胁迫提供必需的能量和物质，但过大的骤降温差显著抑制了鱼体的抗氧化和免疫能力及消化酶活性，对肝脏组织也可能造成了一定程度的损伤。此外，建议在子二代中华鲟的运输操作过程中，水温骤降温差应小于6 ℃，以避免其对鱼产生不利影响。