大鼠早期急性胰腺炎外周血及胰腺组织中PTEN表达水平及其意义的研究

张高峰，汤礼军

急性胰腺炎是消化系统的常见疾病，常见病因有胆源性、高脂源性和酒精性，依据病情轻重可分为急性轻症胰腺炎、中重度胰腺炎及急性重度胰腺炎。急性轻症胰腺炎死亡率常较低，急性重症胰腺炎目前死亡率仍然可达30-50%[1, 2]。对急性胰腺炎病情的早期评估有许多评分系统、影像学资料及生化资料。

PTEN(phosphatase and tensin)是1997 年发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN 作为肿瘤抑制基因，对酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases，RTK)、磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) 、蛋白激酶B( protein kinase B，PKB又称Akt)信号通路的调节有关键作用。PTEN 在体内可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，引发一系列级联反应，影响细胞生存、增殖和代谢，从而抑制肿瘤的发生发展[3]。近年来许多的研究证明PTEN与免疫和炎性疾病有关系[4-6]。本实验就大鼠急性胰腺炎早期，PTEN在外周血水平及在胰腺组织中的表达做一研究。

1 材料与方法

1.1 模型的建立及分组 实验大鼠选用SPF级的8周龄雄性大鼠36只[简阳达硕动物科技公司，SC XK(川)2004]，分为A组、B组和C组，每组12只。大鼠术前禁食12h，A组与C组用1.5%戊巴比妥钠0.25ml/100g(上海国药集团化学试剂公司)麻醉大鼠后，常规备皮、消毒、铺巾，做腹部正中切口开腹，找到胰腺后，用一次性静脉输液针(山东威高公司)从胰胆管自十二指肠开口处逆行穿刺进入胰胆管，用微量注射泵(浙江浙大医疗设备有限公司)注射4%牛黄胆酸钠(北京索莱宝科技有限公司)，C组大鼠在关腹前安置一根腹腔引流管，B组开腹后仅翻动胰腺，不做药物注射。

1.2 标本采集 分别于手术后12小时、24小时两个时相点对三组大鼠采血并处死大鼠，取其胰腺。采血后以3000RPM离心5分钟，取上清液，-80℃冰箱冻存。胰腺一部分立即置于液氮中，然后冻存于-80℃冰箱。剩余部分用生理盐水简单清洗后固定于10%中性甲醛内。

1.3 指标的检测 取上述血清，解冻后使用全自动生化仪检测淀粉酶及脂肪酶；血清中的PTEN蛋白的检测，采用ELISA法，按照试剂盒说明书(武汉博士德生物工程公司)检测血清中PTEN蛋白表达水平。对大鼠胰腺中的PTEN蛋白检测是把标本用10%中性甲醛固定后，进行脱水、石蜡包埋、4um厚度切片；切片制作完成后进行抗原的热修复，按说明书加入一抗，4℃过夜，标记二抗，DAB显色后苏木素复染，中性树脂封片，光镜下观察切片，细胞内出现棕黄色颗粒或团块为阳性细胞。HE染色是完成4um厚度切片后，依次过二甲苯2次、梯度酒精，苏木素染色、分化、反蓝、伊红复染、过梯度酒精、二甲苯、中性树脂封片，光镜下进行观察并做病理评分。

2 结 果

2.1 三组大鼠的淀粉酶和脂肪酶的比较 通过单因素方差分析 在造模后12小时和24小时，三组大鼠血清淀粉酶水平差异有统计学意义(F=58.73、45.75，P<0.05)；通过LSD两两比较，A组和C组的淀粉酶均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组淀粉酶高于C组，但差异没有统计学意义(P>0.05)。三组大鼠血清脂肪酶水平差异有统计学意义(F=40.72、46.46，P<0.05)；通过LSD两两比较，A组和C组的脂肪酶均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组脂肪酶高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1

表1 三组大鼠淀粉酶和脂肪酶比较

2.2 三组大鼠胰腺病理评分 胰腺的HE染色发现，在A组中，出现了大片胰腺腺泡的坏死、出血和炎症细胞的浸润，而在C组中，胰腺表现为坏死程度及炎症细胞浸润程度较少一些，B组为并未出现胰腺充血、水肿、坏死(如图1)。三组大鼠胰腺病理评分差异有统计学意义(F=47.73、28.5，P<0.05)；A组和C组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组大鼠胰腺病理评分

图1 各组大鼠HE染色(HE×200)

2.3 三组大鼠胰腺组织PTEN检测结果 用免疫组织化学法检测PTEN蛋白在各个组之间的表达(图2)，结果通过图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行分析，PTEN在三组间的表达差异有统计学意义(F=131、66，P<0.05)；在A、C组中，PTEN的表达(图中棕黄色颗粒)高于B组，差异有统计学意义P<0.05，A组的表达高于C组，差异有统计学意义P<0.05

图2 各组大鼠PTEN的表达(免疫组化×400)

组别nFNA组12h625512±3890*#A组24h626894±6013*#B组12h63292±999B组24h63379±703C组12h6 13064±1204*C组24h69693±1972* *与B组比较,P<0.05,#与C组比较,P<0.05

2.4 外周血中PTEN的检测结果 通过单因素方差分析，在造模后12小时和24小时，三组大鼠血清PTEN水平差异有统计学意义(F=58.73、45.75，P<0.05)；通过LSD两两比较，A组和C组的血清PTEN蛋白均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组PTEN高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。详细结果见表4。

表4 外周血中PTEN检测结果

3 讨 论

急性胰腺炎是消化系统的一种常见的急性炎症，因为其分型的不同，预后的差别较大，干预和治疗的措施也不同，所以早期对病情的预测显得非常重要。目前对于AP早期的预测，较公认的是一些评分系统，如急性生理和慢性健康状况评分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHE Ⅱ)、Ranson评分、AP严重程度床边指数评分(bedsideindex for severity in acute pancreatitis, BISAP)[7]与CTSI[8]评分等。这些评分系统对AP早期病情的评估有较大帮助，但他们各自的局限性也不能忽略。如Ranson评分需入院后48小时才能完成，可能会错过干预治疗的黄金时机；APACHE Ⅱ评分项目太过复杂，临床运用是有一定局限性；CTSI评分则依赖于设备，同时某些患者对造影剂过敏也影响其在临床上的运用。因此，对于AP早期预测的因素也一直未停止探索。

PTEN在肿瘤的相关研究中较多，PTEN可影响细胞的增殖代谢，抑制肿瘤的发生与发展，PTEN在细胞的周期的生命活动中有重要的作用，对目前研究肿瘤的相关治疗有重要的意义[9]。近年来，也有许多研究表明PTEN与炎症有关。在炎症反应中，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的趋化需要PI3K的调节，而抑制PI3K就能抑制微生物产物、炎性产物和许多趋化因子对白细胞趋化的诱导，而PTEN可负性调控PI3K，从而在炎症反应调控中起到重要的作用[9, 10]。在细胞免疫与体液免疫方面，PTEN也与许多调节有关[6, 11, 12]。正是基于PTEN与炎症之间的关系较为密切，因此本实验选择PTEN作为研究对象。

在本实验中，A组和C组早期的淀粉酶、脂肪酶明显高于B组,胰腺病理评分也明显高于对照组，因此对急性胰腺炎造模是成功的；本团队既往有实验证实急性胰腺炎早期行腹腔置管引流能明显改善急性胰腺炎症的情况；本次实验中，经早期置管引流后，C组的胰腺病理评分明显低于B组。

在本实验中，PTEN表达在A组和C组明显高于B组,PTEN在急性炎症早期即有变化，对急性胰腺炎早期的预测可能有一定的帮助。许多文献都倾向于PTEN是一个炎症的负性调节因子，但在本实验中，在胰腺病理评分较高的组别，PTEN的表达相对较高，在胰腺病理评分较低的组别反而表达更低。当然，也有文献报道，PTEN在巨噬细胞也具有调节作用，但并非简单的负性调节作用，具有两面性，不同巨噬细胞刺激因子导致其作用不尽相同，具体机制尚未阐明。目前PTEN是否参与了急性胰腺炎早期的炎症调节、在哪里环节进行调节，还需进一步的实验来验证。

本实验结果显示，PTEN可能作为大鼠急性胰腺炎病情严重程度早期预测的指标。