某规模化猪场暴发仔猪轮状病毒感染致腹泻的诊断

郭倩妤，汤德元*，石远菊，叶 丽，杨 伟，廖少山，张 森

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

2019年3月下旬，贵州省铜仁市某规模化猪场约2周龄仔猪出现精神沉郁、食欲减退、水样腹泻等症状，用庆大霉素、氟哌酸等药物治疗后不见任何好转，发病3～5 d后部分发病仔猪脱水死亡，疑为病毒性腹泻。于是随机采集了9份发病猪肛门拭子和发病猪1头送我院临床实验室进行诊断检测，通过对该猪场流行病学调查、送检的发病猪临床症状观察、病理解剖诊断和对猪轮状病毒（PoRV）、猪流行泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）毒的RT-PCR检测，确诊导致该猪场大量仔猪腹泻死亡的原因为猪轮状病毒感染。现将诊断检测结果报告如下。

1 发病情况及病料的采集

该猪场有5窝仔猪突然出现食欲减退、呕吐、粥样或水样腹泻、精神沉郁、互相拥挤、喜扎堆等症状，同一圈舍内的仔猪相继发病，出现相同症状，个别哺乳母猪出现了一过性的腹泻。随着病程发展，发病仔猪消瘦，日龄较小的发病仔猪逐渐食欲废绝、严重水样腹泻进而脱水死亡。发病仔猪排泄物呈黄色或白色，偶见未消化完全的凝乳块，有恶臭气味。

样品采集使用棉拭子在生理盐水中浸湿，插入待采样仔猪的肛门2～3 cm，使用棉拭子在肛门内轻轻擦涂，然后将棉拭子放入盛有生理盐水的1.5 mL EP管内。完成采集后，将采集到的样品放入有冰袋的保温采样箱内尽快送往实验室。

2 临床症状

送检发病仔猪消瘦、卧地不起、极度衰弱、眼窝下陷、发抖、四肢偶有抽动，肛门附近粘有黄色粪便，按压皮肤回弹时间较慢，心率约150次/min，体温为36 ℃，呼吸为30次 /min。

3 剖检变化

发病仔猪剖检可见肠道充血、胀气、肠管扩张呈半透明状，肠系膜淋巴结肿大、充血，胃内充满未消化的凝乳块。

4 四种腹泻病毒的RT-PCR检测

根据猪群的发病特征，对送检的样品分别进行了PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR检测，以便确诊该猪场仔猪发生腹泻的病因。

4.1 核酸提取

拭子样品使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释，使棉拭子上附着的病料充分悬浮于PBS稀释液中，然后将稀释液移入新的1.5 mL EP管中并编号。肠及内容物等病料研磨后反复冻融3次，再用匀浆器研磨20 min后收集匀浆。12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用 TaKaRa Min BEST Viral DNARNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒分别提取总核酸。

4.2 引物设计与合成

根据GenBank中已登录的PoRV VP7（KU886318.1）、PEDV（MH061337.1）、TGEV（KP202848.1）、PDCoV（MH715491.1） 基 因序列，应用GenBank中自带的Primer BLAST功能、DNAStar等软件各设计了一对上、下游引物（见表1），用于扩增相应目的基因片段，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

4.3 RT-PCR反应

分别进行PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR检测，检测体系（25 μL）为2×1 step buffer 12.5 μL，核酸模板2 μL，上、下游引物（表1）各1 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free H2O补充至25μL；反应程序为50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，取5 μL 产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测后经凝胶成像仪拍照记录，结果见图1。其检测结果显示：检测出1 062条带，测序结果与预期条带相符，表明发病仔猪为猪轮状病毒感染。

表1 扩增目的基因的引物及片段大小

5 结果及讨论

根据仔猪发病情况、临床症状和样品RT-PCR检测结果表明，导致该猪场仔猪发生腹泻甚至死亡的病因为猪轮状病毒感染，将扩增产物测序结果与GenBank中的序列进行比对后发现，该序列为A群轮状病毒VP7基因的部分序列。

确诊后及时采取有效措施，避免轮状病毒的场内扩散：对产前母猪紧急接种弱毒疫苗，临产母猪转入已消毒灭菌的单独产房，及时淘汰脱水严重的发病仔猪；初产猪进行2次以上的免疫，并在免疫2 周后监测抗体水平，若抗体水平不足，应在7 d 后再次免疫；已感染的仔猪及哺乳母猪严格隔离饲养，可在饮用水中适当补充电解质液，料槽中可拌入蒙脱石散类吸附剂；未发病的仔猪可由人工喂养，或经擦洗消毒后由同产房未发病的健康母猪喂养；将污染圈舍、器具、设备进行彻底消毒，并将污染物、淘汰猪、病死猪进行无害化处理，严格防止病毒进一步扩散；加强日常饲养的管理，调整、加强待产母猪的日粮，满足其营养需求；饲养环境方面应当保持产房和保温箱的湿度、温度稳定；由于昼夜温差较大，圈舍也应当根据气温及时进行温度管理。此外，在每年的疫病高发季节来临前，还应对母猪进行加强免疫。

仔猪腹泻是规模化猪场常见的疫病，其特点是发病猪精神沉郁、食欲减退、偶有呕吐、严重腹泻导致仔猪脱水死亡[1]。近年来，造成仔猪腹泻的病毒性病原主要有PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV等，这几种病毒常呈单一或混合感染[1-4]。初产母猪所产仔猪相较于经产母猪所产的仔猪更容易感染猪轮状病毒，易于断奶前后发病，成年猪感染后一般不出现临床症状，但被感染母猪可能在围产期排毒，成为感染源[5]。猪流行性腹泻病毒在世界各地的猪场中普遍存在，仔猪感染后死亡率很高，给养猪业带来了很大的经济损失[6]。猪传染性胃肠炎可感染全年龄段的猪，但临床症状可能不同，10 d左右的仔猪被感染后，发病死亡率较高[7]。猪德尔塔冠状病毒于2012年在中国香港首次被报道，主要危害新生仔猪[8]。由于上述病毒感染发病在临床症状上极为相似，常需要使用实验室诊断方法辅助诊断。

图1 棉拭子PDCoV、PoRV RT-PCR检测结果

猪轮状病毒是一种能够引起猪急性传染性肠道疾病的重要病毒性病原，该病毒对1～8周龄仔猪的感染力和致病力较强[9-10]，发病仔猪死亡率高。轮状病毒导致的感染发病在大部分地区具有一定的季节性，多发于较为寒冷的如秋、冬和早春等时节[1]。由于该病在临床症状上与其他病原造成的猪腹泻很难区分，常需要借助实验室诊断技术才能确定病原，所以文中将病料进行了猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒的RT-PCR检测，最终确定该猪场的发病猪为猪轮状病毒的感染引起的。