断奶日龄对仔猪天然免疫短期和长期的影响

张振玲（编译）

(徐州生物工程职业技术学院动物工程系，江苏 徐州 221006)

断奶日龄对于仔猪的免疫系统和皮质醇都有影响，不同断奶日龄产生不同的后果。刚断奶的仔猪，尤其是那些在20日龄前断奶的仔猪，更易于感染疾病。16或18日龄断奶的仔猪比20日龄断奶的仔猪更容易暴发大肠杆菌引起的腹泻。早期断奶仔猪的中性粒细胞（N）与淋巴细胞（L）的比率（N∶L）的升高预示着急性应激、免疫力下降和细胞因子的产生，而21日龄断奶仔猪的皮质醇升高，淋巴细胞增殖减少。但也有一些研究发现断奶日龄对仔猪的免疫系统（包括适应性免疫能力）没有影响。然而，研究表明，随着断奶日龄的增加，由于免疫系统的不断完善，白细胞群从14日龄时主要参与天然免疫功能的白细胞为主转到21日龄和28日龄主要参与适应性免疫功能的白细胞为主，这意味着断奶日龄对仔猪的内分泌和免疫状态有短期影响。关于断奶日龄对断奶后仔猪免疫应答的影响的科学资料很少。因此，文章研究的目的是确定和描述断奶日龄对仔猪应激反应和免疫状态的短期和长期影响。

1 材料和方法

1.1 试验动物和试验设计

试验仔猪产自于伊利诺伊大学（University of Illinois）厄巴纳研究农场的经产杂交白毛母猪。试验仔猪共72头，分成12窝，每窝6头（3头公阉猪、3头母仔猪），随机分入14日龄或28日龄断奶组。到指定日龄时，每窝3头公阉猪和3头母仔猪被随机分配到机械通风和环境良好的猪圈舍内饲养至20周龄。同性别内试验仔猪体重相近且对所有仔猪均以达到或超过推荐的营养标准（NRC，2000）饲喂，每圈都配备了一个杯状饮水器。

1.2 血样采集

2个断奶日龄组分别于断奶后第1、7、14天以及8、12、16、20周龄时采集血样。使用含有肝素钠的真空容器通过前腔静脉穿刺收集血液样本并将所采血液样本立即置于冰上。饲养至8周龄时开始采血，将猪置于仰卧位采血（采血过程≤1 min），12周龄时，将猪保定，站立时取样（采血过程≤2 min）。

1.3 细胞的分离和计数

将肝素处理的全血（10 μL）加入Isoflow（10 mL; Beckman Coulter, Miami, FL），红细胞被溶解，用Coulter Z1粒子计数器（Beckman Coulter）自动测定总白细胞数。光学显微镜下对白细胞进行人工分离和计数以确定各种白细胞数量的百分比。全血用RPMI（Roswell Park Memorial Institute）溶解液（Gibco, Carlsbad, CA）稀释，中性粒细胞分离液（Hisptopaque-1077）（密度：1.077 g/mL；Sigma）和Hisptopaque -1119（密度：1.119 g/mL；Sigma）进行分层，在25˚C，700×g下离心30 min。从Hisptopaque-1077层收集淋巴细胞，在RPMI中洗涤2次再悬浮，并计数。从Hisptopaque-1119层中除去中性粒细胞和红细胞，在RPMI中冲洗1次，用低温无内毒素水溶解红细胞，用10×PBS恢复其等渗性。中性粒细胞在475×g下离心10 min，取上清液，洗涤2次，再悬浮于RPMI中。根据免疫分析的要求，用RPMI调节细胞浓度。

1.4 免疫分析

自然杀伤细胞（NK）的细胞毒性是使用购买的非放射性细胞毒性检测试剂盒（罗氏诊断，印第安纳波利斯，IN）测量的。简言之，猪淋巴细胞被用作效应细胞，K-562慢性人骨髓源性白血病细胞（美国组织型培养物，Manassas，VA）作为靶细胞。淋巴细胞（浓度）调到 1×107个 /mL，K 562细胞调至10 000个/孔。分析样品设置3个重复和4个处理〔效应器（淋巴细胞）：靶细胞（K-562）分别 为 12.5∶ 1、25∶ 1、50∶ 1和100∶1〕。用微型平板阅读器（BIO-TEK仪器）在490 nm波长和690 nm的参考波长下读取结果。如果最大释放数除以自发释放数≤20%，分析结果认为有效。

中性粒细胞趋化性采用之前描述的测定方法测定。简单说就是用浓度为3×106个/mL的中性粒细胞，评估中性粒细胞迁移至分析培养基（对照组；随机迁移）或重组人补体 -5a（hc5a；10-7m ；Sigma）（趋化性测试组；定向迁移）的能力。中性粒细胞吞噬功能采用以前所描述的方法（略有修改）使用流式细胞仪测定的。荧光珠与非热灭活猪血清孵育30 min后，按10∶1（珠粒/中性粒细胞）比例添加到样品中。细胞和珠粒被一起孵育45 min，然后通过流式细胞仪评估细胞吞噬荧光颗粒的百分比。

1.5 血浆分析

血浆总免疫球蛋白（IgG）用ELISA法测定，如Niekamp等在2007年所述。用0.05% Tween-PBS活性剂稀释猪血浆样品至1∶3 000。在96孔微孔滴定板上分别滴入120 μL稀释样品或标准品，涂上一层 猪 IgG（Jackson Immunoresearch,West Grove, PA）。兔抗猪IgG （120μL；Sigma，St.Louis，MO）， 在 25 ˚C下孵育2 h，然后用0.05% Tween-PBS活性剂洗涤3次。加入酶联抗兔IgG（200μL；Jackson Immunoresearch），稀释倍数为1∶7 500，平板孵育1 h，倒去液体后再洗3次。加入底 物 溶 液（200 μL；1 mg/mL 对硝 基 苯 磷 酸 酯；Sigma），30 min后， 用 2 M 的 100 μL NaOH 停止反应。用微型平板阅读器（Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）在405 nm波长读取平板，用标准曲线（0，0.1，0.5，1，5，10，20，40 μg/mL）测定血浆总IgG。血浆皮质醇的测定是用购买的里亚试剂包（RIA kit） (Coat-A-Count; Diagnostic Products, Los Angeles, CA）对猪样品进行的，组内和组间变异系数分别为7.0%和13.5%，最低可检测浓度为2 ng/mL。

1.6 统计分析

使用SAS进行统计分析（SAS，2012）。检验数据是否偏离正态分布，对所有偏离正态分布的数据进行自然对数变换。采用线性混合效应模型，分析跨断奶日龄的所有变量，包括保育和育肥期重复的仔猪变量以及日龄对仔猪BW的影响。模型的固定因素为2个断奶日龄处理（14和28日龄）、断奶时间（d 0、第1、7、14天和8、12、16、20周龄）和性别（母仔猪和阉割公仔猪）。随机因素包括窝和圈。拟合了具有协方差结构的重复测度模型以解释猪内重复测定变量的性质。分别用SAS程序的Means和estimate方法比较不同时间点和2个断奶日龄在每个时间节点的影响。显著性设定为P≤0.05。

2 试验结果

2.1 断奶日龄对免疫状况的影响

28日龄断奶仔猪d 0的白细胞总数和淋巴细胞计数均极显著地高于14日龄断奶仔猪（P＜0.01；表1），NK细胞毒性和血浆皮质醇浓度亦均极显著高于14日龄断奶的仔猪（P＜0.01；表2）。14日龄断奶仔猪的中性粒细胞吞噬能力极显著高于28日龄断奶的仔猪（P＜0.01；表2）。14日龄断奶仔猪白细胞总数和中性粒细胞计数在断奶后第7天均显著高于d 0（P＜0.05；表1），淋巴细胞计数和百分比在断奶后第1、7、14天亦均显著低于d 0（P＜0.05；表1），中性粒细胞百分比和N∶L比值在断奶后第1、7、14天均显著高于d 0（P＜0.05；表1）。相反，28日龄断奶仔猪的白细胞总数、淋巴细胞数和中性粒细胞计数在断奶后第1、7天与d 0相似，但是总白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞计数在断奶后第14天均显著高于d 0，中性粒细胞百分比和N∶L比值断奶后第1天均显著高于d 0（P＜0.05，表1）。

无论是14还是28日龄断奶的仔猪在断奶后第1天的NK细胞毒性均与d 0相似，但14日龄断奶仔猪的NK细胞毒性在断奶后第7、14天极显著低于d 0（P＜0.01）。28日龄断奶仔猪的NK值在断奶后第7天极显著低于d 0（P＜0.01；表2）。14日龄断奶仔猪中性粒细胞吞噬能力在断奶后第1天极显著高于d 0（P＜0.01；表2），但是吞噬功能在断奶后第14天则极显著低于d 0（P＜0.01；表2）。相反，28日龄断奶仔猪中性粒细胞吞噬功能在断奶后第1、7天与d 0相似，而在断奶后第14天则极显著高于d 0（P＜0.01；表2）。无论是14日龄还是28日龄断奶的仔猪中性粒细胞趋化性在断奶后第1天均显著大于d 0；而14日龄断奶的仔猪在第7、14天的趋化性均显著较小，28日龄断奶的猪在第14天的趋化性显著较小（P＜0.05；表2）。无论是14日龄还是28日龄断奶的仔猪，其总IgG水平在断奶后第1、7天与d 0相似；但是在断奶后第14天，14日龄断奶仔猪总的IgG水平显著低于断奶前，28日龄断奶的仔猪IgG水平显著高于断奶前（P＜0.05；表2）。只有在28日龄断奶的仔猪皮质醇才会受到影响，皮质醇在断奶后第7天显著低于d 0，在断奶后第14天显著高于d 0（P＜0.05；表2）。

表1 断奶日龄对断奶前和断奶后仔猪白细胞总数、中性粒细胞（N）、淋巴细胞（L）群和N∶L比值影响

2.2 断奶日龄对应激免疫反应的短期影响

28日龄断奶仔猪在断奶后第14天总白细胞数极显著（P＜0.01）高于14 日龄断奶的仔猪（表1），断奶后第1、7、14天淋巴细胞数极显著（P＜0.01）高于14 日龄断奶的仔猪。28日龄断奶仔猪断奶后第7、14天的淋巴细胞百分比和中性粒细胞均极显著数（P＜0.01）高于14日龄断奶的仔猪；14日龄断奶仔猪在断奶后第7、14天的N∶L比值极显著大于28日龄断奶仔猪（P＜0.01；表1）。28日龄断奶仔猪在断奶后第14天血浆IgG水平极显著高于14日龄断奶的仔猪（P＜0.01；表2），在断奶后第1、14天皮质醇也极显著高于14日龄断奶仔猪（P＜0.01；表 2）。

2.3 断奶日龄对应激免疫反应的长期影响

14日龄断奶仔猪在8周龄时的白细胞总数和8、12、20周龄时的淋巴细胞数均极显著（P＜0.01）高于28日龄断奶的仔猪（表3），8、12、16和20周龄时自然杀伤细胞的细胞毒性亦均极显著大于28日龄断奶的仔猪（P＜0.01；表4）。而28日龄断奶仔猪在8周龄时中性粒细胞吞噬功能（P＜0.01）以及8和12周龄时中性粒细胞趋化性（P＜0.01）和总IgG（P＜0.05）均极显著或显著高于14 日龄断奶的仔猪（表4）。14日龄断奶仔猪在12周龄时的皮质醇浓度和20周龄时的中性粒细胞趋化性均较高（表4）。

3 讨论

试验结果表明，断奶日龄对参与断奶应激的白细胞数量、天然免疫参数和总IgG浓度均有不同程度的短期和长期影响。正如之前报道的那样，断奶确实会引起仔猪应激反应，不管断奶日龄是多少，断奶后第1天外周淋巴细胞和中性粒细胞的转移导致N∶L的比率升高。而这种白细胞转移在28日龄断奶仔猪中是短暂的，因为它们在断奶后第7天就回复到了断奶前的基准水平。GINK等人也研究了类似的断奶免疫变化，但是不管仔猪断奶日龄是多少，断奶1周后都能恢复到基线水平（断奶前）。相反，14日龄断奶的仔猪则不是如此，白细胞状况表明了14日龄断奶仔猪长期持续存在断奶应激。尤其是14日龄断奶猪在断奶后第7天和第14天，外周血中中性粒细胞的增多和淋巴细胞的减少导致N∶L比值显著升高。中性粒细胞在应激反应下在外周增殖，导致中性白细胞减少以及N∶L 比值升高，这是应激压力的表现。应激引起的循环淋巴细胞减少主要不是由于大规模的细胞遭破坏，而是由于糖皮质激素引起的淋巴细胞的“输送”或重新分布（从血液到其他身体部位）。这些变化被认为是为了确保不同类型的细胞在应激反应中被传送到需要它们的地方。

表2 断奶日龄对断奶前（d 0)和断奶后第1、7、14天仔猪天然免疫、免疫球蛋白G以及皮质醇的影响

有趣的是，14日龄断奶仔猪由断奶应激引起的中性粒细胞减少反应与皮质醇升高无关，事实上，在断奶后第1、7、14天，仔猪的皮质醇浓度保持不变，与28日龄断奶的仔猪相比，14日龄断奶仔猪的皮质醇浓度较低。在断奶应激压力下皮质醇浓度不发生变化令人惊讶，因为皮质醇浓度的增高与断奶是有关的，但很快（＜7d）皮质醇浓度就回复到基准水平。因此，皮质醇升高并不是导致14日龄断奶仔猪在第1、7、14天断奶后白细胞数量变化的主要因素，这是合理的。28日龄断奶仔猪应激表现为白细胞的变化，但这种变化在断奶后第7天不明显；而14日龄断奶仔猪对断奶应激的反应更为严重。然而，尽管14日龄断奶仔猪的白细胞分布和N∶L比值表明对断奶有应激反应，但这些变化并不影响中性粒细胞或淋巴细胞的功能。中性粒细胞吞噬作用和趋化性是吞噬细胞的机制，它们是宿主对病原微生物天然防御所必需的，在断奶后第1天（吞噬作用）和第7天（趋化性）增强了中性粒细胞的功能，这意味着14日龄断奶仔猪仍有活跃的天然免疫应答（尽管N∶L比率有很大的提高）。

此外，伴随着糖皮质激素慢慢升高，N∶L 比值慢慢升高，免疫细胞数量减少，这些变化往往不是短暂的，也不会在应激压力消退时发生逆转。尽管14日龄断奶仔猪的N∶L 比值慢慢升高，但皮质醇浓度并没有随之慢慢升高，白细胞谱也发生了逆转，因为N∶L比值没有持续升高，到8周龄时总白细胞和淋巴细胞数量增加了。但从长期来看，14日龄断奶仔猪的中性粒细胞功能可能受到影响，与28日龄断奶仔猪相比，14日龄断奶仔猪在8周龄和12周龄时仔猪中性粒细胞吞噬功能和趋化性均较低。与28 日龄断奶仔猪相比，14日龄断奶猪在8、12、16、20周龄有更活跃的NK活性（天然免疫）和更低的总IgG（适应性免疫），提示断奶日龄可能对猪的免疫反应有长期影响（14日龄断奶猪的天然免疫反应较强，28日龄断奶猪的适应性免疫反应较强）。14日龄断奶仔猪在天然免疫方面有一个长期的权衡或折衷（降低中性粒细胞功能，以增强NK 细胞毒性）似乎是合理的。

表3 断奶日龄对8~20周龄猪白细胞总数、中性粒细胞(N)、淋巴细胞(L)和N∶L比值的影响

表4 断奶日龄对8~20周龄猪天然免疫、免疫球蛋白G 和皮质醇的影响

仔猪刚出生时免疫功能非常脆弱，其免疫系统通常要到约1个月大时才能发育完全。新出生动物在适应性免疫系统发育前必须主要依靠他们的天然免疫系统。我们以前的工作证实了随着猪的年龄增长，IgG浓度和有丝分裂引起的B细胞增殖减少，这些结果与之前报道的相似。然而，在这项研究中，14日龄断奶的仔猪在长期内没有更发达的适应性免疫反应，而是更发达的天然免疫反应。NK细胞毒性是与自然杀伤淋巴细胞功能相关的体内天然免疫措施，是抵御病菌攻击的第一道非特异性防线；而IgG是一种抗体，主要参与抗体反应，是第2道防线。Niekamp等发现28日龄断奶猪的NK活性较高，且随着年龄的增长，NK活性增加。Annamalai等发现9日龄哺乳仔猪检测不到NK活性而26日龄猪的NK活性较高。相反，我们发现14日龄断奶仔猪的d 0的NK活性更大，但由于应对应激压力，断奶后却减弱了，但是仍远高于28日龄断奶仔猪在14日龄至20周龄间的NK活性水平。但是14日龄断奶仔猪在20周龄时IgG水平较低。这些发现与之前的研究相矛盾，但这些差异可能部分归因于本研究与之前工作的不同，尤其是缺乏光周期处理、不同的血液取样时间表和本研究的持续时间较长等。但是，这也是有道理的，根本原因就在于14日龄断奶仔猪的白细胞谱。不管怎么样，从长期来看那些14日龄断奶仔猪的天然免疫反应（NK活性）更活跃；而28日龄断奶猪的体液免疫反应（适应性免疫）则更强。

4 结论

总之，无论是14日龄还是28日龄断奶都存在断奶应激压力，仔猪在免疫方面有短期也有长期的变化。14日龄断奶仔猪断奶后不久的免疫差异（与断奶前相比）更大且持续时间更久。从白细胞数量、中性粒细胞功能和NK活性的变化方面看，14日龄断奶仔猪在断奶后第7天和第14天，对断奶有严重的应激反应；而晚断奶（28日龄断奶）的仔猪在断奶后第7天所有参数就恢复到基准水平（d 0）。此外，本研究还表明断奶日龄和断奶应激反应对天然免疫和抗体的产生有着不同和长远的影响：14日龄断奶仔猪在20周龄时NK活性更大，而28日龄断奶仔猪则抗体（IgG）免疫反应较强。因此，断奶日龄可能会对猪的免疫状态产生长期的影响。

（原文：Salak-Johnson J L,Webb S R. Short-and Long-Term Effects of Weaning Age on Pig Innate Immune Status[J]. Open Journal of Animal Sciences, 2018, 8(2): 137-150.）