不同部位与处理对三叶青茶总黄酮含量的影响

洪春桃，沈登锋，魏斌，章建红

(宁波市农业科学研究院 林业研究所，浙江 宁波 315040)

三叶青(Tetrastigmahemsleyanum)，中文学名为三叶崖爬藤，又名蛇附子、石抱子、金线吊葫芦、三叶对、小扁藤、三叶扁藤、拦山虎、雷胆子等，药名为三叶青，是葡萄科崖爬藤属多年生蔓生藤本植物，为中国特有珍稀药用植物[1-2]。药理试验表明，三叶青具有抗肿瘤、抗炎、解热镇痛、抗病毒、保肝和免疫调节等多种药理作用[3-6]，且长期应用未见毒副作用，是西药无法代替的“植物抗生素”。现代化学分离、分析研究发现，其主要化学成分为黄酮及其苷类化合物，临床上已逐步用于肝癌、肺癌、白血病和艾滋病等疾病的治疗[3-4]。随着人们健康意识的增强，以传统中草药为主要成分的保健茶已成为市场的新亮点。三叶青主要利用部位是块根，但它的茎叶同样具有相应的功能[7-9]，将三叶青茎叶制成茶叶，既可以消除感冒等病症又可以提高免疫力，是未来保健茶中的佼佼者。茶优良品质的形成主要取决于鲜叶质量和加工工艺，因此，选择适宜的制茶工艺对三叶青茶生产具有重要意义。本研究采用正交试验比较了不同加工处理对三叶青茶总黄酮含量的影响，现将试验结果归纳总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶青嫩叶、老叶和幼嫩茎段采自宁波市农业科学研究院横溪镇大岙村的三叶青基地(宁波，浙江)，采摘时间为2018年3月中旬。试剂：芦丁对照品(批号：20200423，购于北京索莱宝科技有限公司)，氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)，95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，三氯化铝(阿拉丁)等。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，恒温水浴锅(上海慧泰仪器制造有限公司)，超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，酶标仪(Thermo Fisher Scientific，USA)，高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific，USA)等。

1.3 处理设计

1.3.1 三叶青不同加工处理正交试验方法

试验采用3因素3水平的正交试验，对制茶的杀青方式(A)、干燥方式(B)、取材部位(C)进行对比探讨[10-11]，并测定试验组的总黄酮含量，作为筛选较佳制茶加工条件的依据。杀青方式：1，锅炒；2，微波；3，蒸汽[11]。干燥方式：1，锅炒干燥；2，冷冻干燥；3，烘箱干燥。取材部位：1，嫩叶；2，老叶；3，嫩茎段，其中嫩叶采用每个枝条顶端的前6轮叶子，老叶为6轮以下的叶子，嫩茎段为顶端的前5段。杀青方式：锅炒杀青按传统经验，高温，2 min；微波杀青：800 W，0.5～1.0 min；蒸汽杀青：100 ℃，1 min。干燥方式：炒干，30～60 min；冷冻干燥，-60 ℃，12～24 h；烘干，60 ℃，8 h。具体处理组别见表1。

1.3.2 三叶青不同制茶加工样品的制备

采集样品后先进行挑选，将嫩叶和嫩茎段分开，再进行清水漂洗、滤水、摊晾，待没有水迹后进行称量、分组、制备。将称量好的嫩叶、老叶和嫩茎段分别按照表1处理方式进行试验，并将干燥处理后的样品密封包装，置于干燥器中保存用于总黄酮含量测定。

1.3.3 总黄酮含量测定

标准曲线的制备：精密称取芦丁标准品5.00 mg，加适量70%乙醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度。将芦丁配成200.0 μg·mL-1的标准溶液，分别吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10% AlCl3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加4% NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀放置15 min，于500 nm处测定吸光度[11-12]。所得数据经回归处理得到芦丁浓度与吸光度间的线性关系：y=0.005 7x-0.033 6，R2=0.9973，y为芦丁浓度，x为样品吸光度。

三叶青茶总黄酮含量测定：将不同组别样品碾碎，分别放入研钵中研磨呈粉末，粉碎过100目筛，可得到三叶青茶粉，准确称取各组三叶青茶粉0.1 g，按1 g∶25 mL料液比加入70%乙醇溶液，超声提取2次，每次超声温度为60 ℃，时间为25 min，合并提取液，离心，取上清液测定总黄酮含量。取0.1 mL样品溶液，根据本文标准溶液测定方法测定其在500 nm处的吸光度，计算黄酮得率。将各组数据输入SPSS 18.0软件进行方差分析。

总黄酮得率计算公式：100CV1V2÷m÷V3。

式中：C表示测定液的总黄酮质量体积分数(mg·mL-1)；V1表示测定液的定容体积(mL)；V2表示提取液的定容体积(mL)；m表示样品质量(g)；V3表示测定时量取的体积(mL)[12]。

1.4 数据统计

数据采用SPSS 18.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

通过L9(34)正交试验设计，比较了不同加工处理对不同部位三叶青茶样品总黄酮含量的影响，结果如表1所示。以幼嫩茎段为材料，采用锅炒的杀青方式，烘干的干燥方法获得总黄酮含量最高，为7.81%。通过正交试验主体间效应检验分析可知，不同制茶工艺条件下，材料部位和干燥方式对总黄酮含量有显著差异(分别为P=0和P=0.004)，而杀青方式对总黄酮含量无显著性影响(P=0.061)，根据F值大小判断影响总黄酮含量的因素顺序为材料部位(4 263.255)>干燥方式(231.618)>杀青方式(15.369)。

表1 三叶青不同制茶工艺处理组合的总黄酮含量

2.2 不同杀青方式对三叶青茶总黄酮含量的影响

根据正交试验结果，将不同杀青方式下三叶青茶总黄酮含量进行统计分析可知，锅炒、微波和蒸汽杀青方式下总黄酮含量分别为5.81%、5.86%和5.69%。采用LSD多重比较分析得出，锅炒的杀青方式与微波和蒸汽杀青方式之间没有显著差异(P>0.05)，而微波杀青和蒸汽杀青方式之间存在显著差异。

2.3 不同干燥方式对三叶青茶总黄酮含量的影响

根据正交试验结果，将不同干燥方式下三叶青茶总黄酮含量统计分析可知，炒干、冻干和烘干3种干燥方式下总黄酮含量分别为5.77%、5.38%和6.11%。采用LSD多重比较分析得出，3种干燥方式之间三叶青茶总黄酮含量均存在显著差异。

2.4 不同材料部位对三叶青茶总黄酮含量的影响

根据正交试验结果，将不同材料部位的三叶青茶总黄酮含量统计分析可知，嫩叶、老叶和嫩茎段的总黄酮含量分别为5.30%、4.46%和7.51%。LSD多重比较分析表明，3种材料部位的三叶青茶总黄酮含量均存在显著差异。

3 小结

三叶青作为新入选的“浙八味”[13]，药用价值不可小觑，具有“天然抗生素”的美誉，而其入药部位主要是块根[1,3-4,6-8]，对茎叶的研究利用相对较少。本研究通过对三叶青茎叶制茶工艺条件的探索，提高了三叶青茎叶的利用率，也增加了三叶青全株入药的科学依据。三叶青茎叶制茶时，采用幼嫩茎段作为制茶部位，获得的三叶青茶总黄酮含量较高，这与前人研究结果一致[14]。用蒸汽法杀青方式所测得的各组总黄酮含量均较低，可能是由于蒸汽杀青高温高湿，迅速破坏了三叶青茎叶中的总黄酮，导致有效成分降低，因而不宜采用蒸汽法杀青。根据总黄酮得率越大越好，且考虑成本等因素，筛选的三叶青制茶的加工处理工艺为选择嫩茎段，锅炒杀青，烘干。