Shh蛋白在人脑胶质瘤中的表达及其意义

刘海英 张秋实 苏旭明 张学新

河北医科大学第四医院神经外科 河北石家庄 050012

胶质瘤是颅内最常见的原发性脑肿瘤，具有高增殖性、浸润性生长，易复发等特点，临床治疗效果较差[1]。恶性程度最高的胶质瘤病人的中位生存期只有14.6 个月，5年生存率仅为9.8%。究其原因可能与胶质瘤细胞的多形性、胶质瘤干细胞的无限增殖以及多信号通路的共同激活有关[2]。因此，深入研究胶质瘤的发生、发展的分子机制，寻找其发生发展的规律，探究肿瘤相关分子机制是治疗胶质瘤的一项重要手段。研究显示SHH（Sonic Hedgehog）信号通路在胚胎发育尤其是神经系统发育中起到重要作用。不仅如此近年来研究也证明，SHH 信号通路在多种肿瘤如髓母细胞瘤、胃癌、肝癌、基底细胞癌、肺癌、前列腺癌等的发生发展中起重要作用[2-6]。

Shh 蛋白是SHH 信号通路的启动因子，是一种由上皮细胞分泌的，具有高度保守性的分泌型糖蛋白[7]。以往的研究中显示，其表达程度可直接反应Shh 信号通路的激活状况[6,9]。而在胶质瘤中SHH 信号通路及Shh 蛋白的表达情况目前尚显有报道。因此本研究旨在利用免疫组化技术，探究人脑胶质瘤中SHH 信号通路中核转录因子Shh 蛋白的表达情况，探寻胶质瘤的发生发展的相关机制，为临床实践提供一定的帮助。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集我院神经外科自2014年5月至2018年5月资料完整的行开颅手术患者肿瘤标本，经病理证实为胶质瘤标本75 例。其中男性39 例，女性36 例。年龄17-72 岁，中位年龄49.2 岁；病理学分级依据2016年WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准，分为四组：Ⅰ级13 例，Ⅱ级16 例，Ⅲ级21 例，Ⅳ级25 例。选取同期因脑外伤手术患者非肿瘤脑组织10 例作为对照组。

1.2 试剂

兔抗人Shh 单克隆抗体（Abcam 公司）、SP9001 免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术开发公司）。

1.3 免疫组织化学法检测胶质瘤及正常脑组织中Shh 的表达

将取得的胶质瘤标本、非肿瘤脑组织经甲醛溶液固定后，石蜡包埋切片，梯度复水后3%过氧化氢(H2O2)室温避光孵育30min，PBS 冲洗2 次，EDTA 热修复后PBS 冲洗2 次，血清封闭液37℃温箱封闭1h，吸取多余血清后滴加一抗(shh 1:100)，4℃孵育过夜。次日PBS 冲洗2 次，加入生物素标记的二抗，37℃温箱孵育30min，PBS 冲洗2 次，加链酶卵白素工作液，37℃温箱内孵育30min，PBS 冲洗2 次，DAB 显色，复染。光镜下观察结果并拍照。

Shh 免疫组化表达均主要为细胞膜及细胞质中。采用Friedrich 等 的 免 疫 反 应 评 分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量标准：高倍视野下随机选取5 个视野，计数200 个细胞，阳性细胞≤10%为0 分；＞10%-50%为1 分；＞50%-75%为2 分；＞75%为3 分。染色强度标准：无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。总体评价：以上述2 项得分相乘：0 分判为“-”，1 分～4 分判为“+”，5 分～7 分判为“++”，≥8 分判为“+++”。以“++”和“+++”定义为阳性，“－”和“+”定义为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验或Fisher 确切概率法；组间比较采用非参数秩和检验。以P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

Shh 蛋白表达于胶质瘤细胞胞膜、胞质中。Shh 蛋白的表达在Ⅰ级胶质瘤中为23.07%(3/13)，Ⅱ级37.50%(6/16)，Ⅲ级61.90%(13/21)，Ⅳ级76.00%(19/25)，正常脑组织中为10%（1/10），各胶质瘤组与对照组比较具有显著差异（P＜0.05）。

2.2 Shh 蛋白表达与胶质瘤临床病理参数的关系

Shh 蛋白表达与胶质瘤患者的年龄、肿瘤大小、术前KPS 评分及是否为复发性肿瘤无关（P＞0.05）。Shh 蛋白的表达与胶质瘤WHO 分级明显相关，胶质瘤各组间比较，随肿瘤病理级别的增高，Shh 蛋白的表达逐渐增强，阳性率增高，差异有统计学意义（χ2=29.054，P＜0.05）（表1）。

表1：胶质瘤Shh 蛋白表达与临床病理参数的关系

3 讨论

SHH 信号通路在普遍存在于正常的人体组织中，对于胚胎发育、细胞成熟、细胞分化、内分泌激素的产生有着不可替代的重要作用。作为SHH 信号通路的启动因子，当shh 蛋白与Ptch 蛋白结合后，Smo 蛋白的抑制作用被解除，Gli 蛋白的水解作用被抑制，从而使Gli 蛋白以全长的形式进入细胞核，发挥其核转录因子的作用，促使靶基因的转录和翻译[8-10]。近年来，随着研究的不断深入，学者们陆续发现SHH 信号通路在肿瘤组织中也有明显的异常激活现象。

研究发现Shh 在原发性非小细胞肺癌中普遍存在，尤其与肺鳞癌的病理分化程度密切相关。而在小细胞肺癌中，Shh 和Gli-1的表达量明显降低[11-13]。阿布拉等[14]等在胰腺癌研究中，发现SHH 信号通路中Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌组织中表达量显著高于胰腺癌旁组织及正常胰腺组织，证实SHH 信号通路在胰腺癌组织中存在异常活化现象；还有研究发现，在小鼠活体中应用Smo 抑制剂环靶明能够诱导胰腺肿瘤细胞凋亡和减少肿瘤组织的形成，改善胰腺癌的预后[15]。

在中枢神经系统肿瘤中，SHH 信号通路研究相对较少。研究发现，在部分髓母细胞瘤组织中存在SHH 信号通路的异常活化现象。其中Ptch-1 的突变与人髓母细胞瘤的关系被广泛证实[16]。何青兰等[17]用RT-PCR 检测体外培养的U251 恶性胶质瘤细胞系及人脑胶质瘤组织中SHH 信号通路因子mRNA 的表达，结果显示在U251 细胞和胶质瘤组织中的Shh mRNA 的表达分别高于其在瘤周组织的表达，提示Shh 的信号通路异常参与了脑胶质瘤的发生发展过程。Wang[18]等研究发现阻断SHH 信号通路可限制胶质瘤细胞的迁移和扩散。Shahi 等[19]研究发现Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形胶质细胞瘤和髓母细胞瘤组织中呈明显的高表达。

本实验以SHH 信号通路中重要的启动因子Shh 作为研究对象，应用免疫组化的实验方法发现10 例正常脑组织中Shh 不表达或仅有弱表达，而在75 例胶质瘤组织中41 例检测到Shh 阳性表达，余下34 例Shh 阴性表达，与对照组比较明显增高，统计学分析有显著差异，说明Shh 在胶质瘤组织中呈高表达。在不同级别胶质瘤间比较，Shh 在高级别胶质瘤中阳性率明显高于低级别组，有统计学意义。上述结果表明：与正常脑组织对比，在各级胶质瘤组织中Shh 在蛋白水平均上调，提示Shh 信号通路在胶质瘤细胞中是普遍激活的，随肿瘤病理级别的增高，Shh 表达逐渐增强，有统计学意义。而Shh 的表达与胶质瘤患者的年龄、肿瘤大小、术前KPS 评分及是否为复发性肿瘤无关。因此从另一个层面来说适时适当干预Shh 的表达，调节Shh 信号通路的激活/失活状态，将有可能作为治疗胶质瘤的一个重要手段。

目前有关SHH 信号通路在胶质瘤方面的研究尚少，积极探究胶质瘤的发生发展的机制仍然有锁欠缺，本研究样本量较少，机制研究深入程度仍需完善，但也为临床治疗胶质瘤提供了一定指导意义，为后续研究打下部分基础。