Gli-1在人脑胶质瘤中的表达及与Ki-67相关性研究

刘海英 张秋实 苏旭明 张学新

河北医科大学第四医院神经外科 河北石家庄 050012

胶质瘤是人中枢神经系统常见恶性肿瘤，约占颅脑肿瘤的47%。其中多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是人中枢神经系统原发的高度恶性肿瘤，约占神经胶质瘤的60%，因其增殖迅速、高浸润性及复发率高等特点导致患者预后很差，中位生存期约14.6 个月，5年生存率不超过10%[1]。因此，深入研究胶质瘤的发生、发展的分子机制，寻找其发生发展的规律，探究肿瘤相关分子机制是治疗胶质瘤的一项重要手段。研究显示SHH（Sonic Hedgehog）信号通路在胚胎发育尤其是神经系统发育中起到重要作用。不仅如此近年来研究也证明，SHH 信号通路在多种肿瘤如髓母细胞瘤、胃癌、肝癌、基底细胞癌、肺癌、前列腺癌等的发生发展中起重要作用[2-6]。

Glioma-associated oncogene 1（Gli-1）是一类含有锌指结构的核转录因子，在多种生物学进程中发挥着关键作用[7-8]。以往的研究中显示，Gli-1 是SHH 信号通路激活中不可缺少的一类转录因子，其表达程度可直接反应Shh 信号通路的激活状况[6,9]。而在胶质瘤中SHH 信号通路及Gli-1 的表达情况目前尚显有报道。不仅如此，Gli-1 与代表肿瘤恶性分化能力的Ki-67 蛋白的相关性研究更是GBM 发生发展机制研究中的一项短板。因此本研究旨在利用RT-PCR 及免疫组化技术，探究人脑胶质瘤中SHH 信号通路中核转录因子Gli-1 的表达情况，探寻胶质瘤的发生发展的相关机制，为临床实践提供一定的指导。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集我院神经外科自2014年5月至2017年5月资料完整的行开颅手术患者肿瘤标本，经病理证实为胶质瘤标本50 例。其中男性28 例，女性22 例。年龄17-72 岁，中位年龄47 岁；病理学分级依据2016年WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准，Ⅰ级9 例，Ⅱ级12 例，Ⅲ级13 例，Ⅳ级16 例，其中Ⅰ级、Ⅱ级作为低级别肿瘤组，Ⅲ级、Ⅳ级作为高级别肿瘤组。选取同期因脑外伤手术患者非肿瘤脑组织10 例作为对照组。

1.2 试剂

兔抗人Gli-1 多克隆抗体（ABGENT 公司）、鼠抗人单克隆抗体Ki-67（武汉博士德生物工程有限公司）、SP9001 免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术开发公司）、反转录试剂盒（Thermo 公司）。

1.3 RT-PCR

于NCBI 基因库查找相应的基因mRNA 序列，应用 Oligo 5.0设计引物，返回NCBI，进行Primer-BLAST，采用特异性较好引物序列。引物序列由Invitrogen 公司合成（表1）。

1.4 免疫组织化学法检测多形性胶质母细胞瘤及正常脑组织中Gli-1 及Ki-67 的表达

将取得的胶质瘤标本、非肿瘤脑组织经甲醛溶液固定后，石蜡包埋切片，梯度复水后3%过氧化氢(H2O2)室温避光孵育30min，PBS 冲洗2 次，EDTA 热修复后PBS 冲洗2 次，血清封闭液37℃温箱封闭1h，吸取多余血清后滴加一抗(Ki67 1:100，Gli-1 1:100)，4℃孵育过夜。次日PBS 冲洗2 次，加入生物素标记的二抗，37℃温箱孵育30min，PBS 冲洗2 次，加链酶卵白素工作液，37℃温箱内孵育30min，PBS 冲洗2 次，DAB 显色，复染。光镜下观察结果并拍照。

Gli-1 免疫组化表达均主要为细胞质及细胞核中，Ki67 免疫组化表达均主要为细胞核中。采用Friedrich 等的免疫反应评分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量标准：高倍视野下随机选取5 个视野，计数200 个细胞，阳性细胞≤10%为0 分；＞10%-50%为1 分；＞50%-75%为2 分；＞75%为3 分。染色强度标准：无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。总体评价：以上述2 项得分相乘：0 分判为“-”，1 分～4 分判为“+”，5 分～7 分判为 “++”，≥8 分判为“+++”。以“++”和“+++”定义为阳性，“－”和“+”定义为阴性。

1.5 RT-PCR 检测多形性胶质母细胞瘤及正常脑组织中Gli-1mRNA 及Ki-67 的表达

将手术取下的各肿瘤组织及非肿瘤脑组织半小时内放入无菌、无酶冻存管，存至-80℃冰箱。组织标本在研钵中碾碎，用TriQuick 总RNA 提取试剂提取组织总R NA，反转录试剂盒获得cDNA，20μl 反应体系进行RT-PCR 反应[Mix 10μl，上游引物 (5μM)0.4μM，下游引物 (5μM) 0.4μM，cDNA 0.4μg，去离子水至20μl]。反应条件：95℃5min，95℃ 30s，56 ℃（Ki-67）/58 ℃（Gli-1）/57℃（GAPDH）30s，72℃ 45s，72℃ 7.5min (35 个循环)。产物经琼脂糖凝胶电泳后分别测定样本基因及对应内参灰度值，以灰度值进行统计学比较。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验或Fisher 确切概率法；计量资料以()表示，组间比较采用非参数秩和检验, 相关性分析采取等级相关分析。用Spearman 等级相关分析法分析人脑胶质瘤组织中Gli-1、Ki-67蛋白表达的相关性，以P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

Gli-1、Ki-67 均高表达于GBM 细胞中。Gli-1 定位于细胞胞质、胞核（见图1），Ki-67 定位于细胞胞核（见图2）。

图1：高级别胶质瘤（A）、低级别胶质瘤（B）、非肿瘤脑组织（C）Gli-1 免疫组织化染色 (×400)图1：Examples of immunohistochemical staining of Gli-1

图2：高级别胶质瘤（A）、低级别胶质瘤（B）、非肿瘤脑组织（C）Ki-67 免疫组织化学法染色 (×400)图2：Examples of immunohistochemical staining of Ki-67

Gli-1 的表达在高级别GBM 中为65.52%（19/29），低级别GBM 中为23.81%（5/21），正常脑组织中为10%（1/10），差异有统计学意义（χ2=12.192，P＜0.01）。（表1）。高级别GBM 与正常脑组织阳性率对比、低级别GBM 与正常脑组织阳性率对比均有统计学意义（P＜0.01）。Ki-67 的表达在高级别胶质瘤中为72.41%（21/29），低级别胶质瘤中为14.28%（3/21），正常脑组织中为10%（1/10），差异有统计学意义（χ2=14.508，P＜0.01）（表2）。

2.2 RT-PCR 结果

GLi-1 mRNA 在高级别胶质瘤、低级别胶质瘤和正常脑组织中的相对表达量分别为0.145±0.020、0.083±0.070、0.060±0.039，P=0.004，差异有统计学意义。其中，高级别胶质瘤与对照组、低级别GBM 与对照组间相对表达量有统计学意义（P＜0.0125）。Ki-67 mRNA 在高级别胶质瘤、低级别胶质瘤和对照组中的相对表达量分别为0.147±0.032、0.113±0.070、0.049±0.035，秩和检验结果：χ2=11.30，P＜0.05，有统计学意义。(表3)。

2.3 相关性分析

采用Spearmen 等级相关分析法，在各级别脑胶质瘤中Gli-1的表达与Ki-67 呈正相关（r=0.68，P＜0.05）。

表1：不同级别胶质瘤和正常脑组织对照组Gli-1 IHC 染色结果比较

表2：不同级别胶质瘤和正常脑组织对照组Ki-67 IHC 染色结果比较

表3：ki-67、Gli-1 mRNA 在不同级别胶质瘤及正常脑组织中的相对表达量

3 讨论

SHH 信号通路在普遍存在于正常的人体组织中，对于胚胎发育、细胞成熟、细胞分化、内分泌激素的产生有着不可替代的重要作用。近年来，随着研究的不断深入，学者们陆续发现SHH 信号通路在肿瘤组织中也有明显的异常激活现象。

Yuan Z 等研究发现，SHH 信号通路在原发性非小细胞肺癌（NSCLC）中存在广泛激活的现象，DNA 芯片检测发现87%腺癌和93%的鳞癌存在GLi-1 的高表达。而在小细胞肺癌（SCLC）中，Gli-1 的表达显著降低[10-12]。证实Shh 信号通路在NSCLC 中普遍存在，且以鳞癌的临床意义最为突出。在胰腺癌中，阿布拉等通过RT-PCR 实验证明Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌组织中表达量明显高于胰腺癌旁组织及正常胰腺组织，在表型为CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干细胞中, Shh 的表达量比正常的胰腺导管上皮细胞高出46 倍[13-15]。在胃癌中，相关研究表明Shh 的缺失与幽门螺杆菌感染及肠上皮化生有关[5,16-17]。Saze 等对胃癌组织的实验研究发现，Shh、Ptch-1 的高表达水平与胃癌的预后不良有显著关系，且Shh 通路中的 Ptch-1 高表达可能与胃癌的进展有关[18]。

Shh 广泛存在于神经系统、皮肤、胃肠、四肢。在神经系统形成过程中，早期成熟分化的神经细胞分泌Shh，作用于远处的Gli（+）神经前体细胞，促进其增殖分化为终末细胞。当终末细胞达到一定数量后，负反馈于成熟的神经细胞，Shh 分泌减少，前体细胞的增生减退，通过这种自我反馈的机制来调节个体发育中脑组织的大小和形状[19,20]。研究显示在神经信号系统成熟后，Shh-Gli 信号通路处于失活状态。而异常激活的Shh-Gli 将引起颅内相关肿瘤的发生发展。Jeng 等[21]研究发现阻断Shh 信号通路可限制胶质瘤细胞的迁移和扩散。Ptch-1 的突变与人髓母细胞瘤的关系也被广泛证实[22]。何青兰等[23]用RT-PCR 检测体外培养的U251 恶性胶质瘤细胞系及人脑胶质瘤组织中Shh 信号通路因子mRNA 的表达，结果显示在U251 细胞和胶质瘤组织 中的Shh mRNA的表达分别高于其在瘤周组织的表达，提示Shh 的信号通路异常参与了脑胶质瘤的发生发展过程。Shahi 等[24]研究发现Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形胶质细胞瘤和髓母细胞瘤组织中呈明显的高表达。

本实验以Shh 信号通路中重要的转录因子Gli-1 作为研究对象，应用免疫组化的实验方法发现10 例正常脑组织中Shh、Gli-1 不表达或仅有弱表达，而在50 例胶质瘤组织中29 例检测到Shh、Gli-1 阳性表达，余下21 例Shh、Gli-1 阴性表达。其中，Shh 在低级别胶质瘤、高级别胶质瘤间对比无统计学意义；Gli-1在高级别胶质瘤中表达量明显高于低级别。RT-PCR 结果表明：Shh、Gli-1mRNA 的相对表达量明显高于正常脑组织。但是Shh mRNA、Gli-1 mRNA 在高级别胶质瘤、低级别胶质瘤间对比，无统计学意义。上述结果表明：与正常脑组织对比，在胶质瘤组织中Shh 和Gli-1 在蛋白水平及基因水平均上调，提示Shh 信号通路在GBM 细胞中是普遍激活的。而在不同级别GBM 细胞中Gli-1 在蛋白水平表达量有统计学意义。

Ki67 是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，与细胞增殖活性以及肿瘤的发生、发展和转移有关，是我国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南(2015)强烈推荐的生物学标记物(I 级证据)[25]。本研究证实，在GBM 细胞中Gli-1 高表达并与Ki-67 呈正相关，这预示着肿瘤细胞的增殖分化能力与Gli-1 有明显的正相关性，Gli-1 表达高的GBM 可能预示着更加不良的预后。因此从另一个层面来说适时适当干预Gli-1 的表达，调节Shh 信号通路的激活/失活状态将有可能作为治疗GBM 的一个重要手段。

目前有关Gli-1 及Shh 信号通路在GBM 方面的研究尚少积极探究GBM 发生发展的机制仍然有锁欠缺，本研究样本量较少，机制研究深入程度仍需完善，但也为临床治疗GBM 提供了一定指导意义，为后续研究打下部分基础。