来源于豆豉的枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的稳定性研究

满丽莉,向殿军

(1.内蒙古民族大学 生命科学学院，内蒙古 通辽 028042；2.内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽 028042)

2008年世界卫生组织的报告显示，每年有1730万人死于心血管疾病，占全球年死亡总数的30%。血栓形成是导致心血管疾病的主要原因，其发病率和死亡率呈现逐年上升趋势。纳豆激酶(nattokinase)是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌产生的一种有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，其具有很强的溶解血栓功能并可激活体内的纤溶酶原，活性是纤溶酶的4倍[1-3]，与目前临床所用的链激酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶等溶栓药物相比，具有作用直接迅速、易被人体吸收、安全性好、药效持续时间长、造价低廉、特异性高等优势，纳豆激酶将是一种很有潜力的新型溶栓药物[4-6]。

稳定性是评价酶的重要参数之一，决定其工业化应用的可行性。纳豆激酶的稳定性好，有利于降低成本，提升酶的催化效率和底物溶解度、降低酶用量。随着纳豆激酶应用范围(如饲料、洗涤剂等)的不断扩大，纳豆激酶在生产过程中需耐受不同的热环境、pH环境、金属离子、化学物质等各种非自然条件，具有较好的稳定性显得尤为重要[7-10]。本研究综合分析了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂和变性剂的稳定性及传代稳定性，旨在为更合理地应用和开发纳豆激酶提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌MX-6(BacillussubtilisMX-6)：由中国豆豉中筛选鉴定获得。

1.1.2 试剂及培养基

试剂：凝血酶，购自中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原和琼脂糖，购自美国Sigma公司；其他药品均为国产分析纯。

基础种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基础发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要仪器设备

SW-CT型超净工作台 郑州南北仪器设备有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK灭菌锅 北京天赐科仪商贸有限公司；BPH-9082型电热恒温培养箱 济南来宝医疗器械有限公司；Microfuge16型离心机 美国贝克曼公司；WS-600型恒温振荡培养箱 德国Wiggens公司；DHP-600恒温培养箱 常州中捷实验仪器制造有限公司；110-801型三量ip67防水原点数显卡尺不锈钢零点电子游标尺 东莞市景有模具五金有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法及粗酶液制备

培养方法：挑取枯草芽孢杆菌MX-6接种于装有50 mL基础种子培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃、160 r/min条件下震荡培养12 h(OD600=1.5～1.6)。

粗酶液制备：将培养的菌液按5%接种于装有50 mL基础发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2、160 r/min条件下震荡培养72 h，制备成纳豆激酶粗酶液。

1.2.2 纳豆激酶活力的测定

发酵液以5000 r/min离心10 min，取10 μL上清液用于纳豆激酶活性的测定。纳豆激酶活力的测定采用纤维蛋白平板法[11]，溶圈直径采用电子游标尺测定。

1.2.3 纤溶酶编码基因aprN的扩增及鉴定

根据GenBank中已公布的纤溶酶编码基因aprN序列，应用Primer软件设计引物，上游引物：5'-GTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTC-3'和下游引物：5'-TCCGGTGCTTGTGAAGATTTTCAGA-3'用于扩增枯草芽孢杆菌MX-6中的aprN基因。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物运用琼脂糖凝胶电泳进行检测并测序。利用NCBI中的Blast及MEGA 6.0分别进行序列比对及系统进化树构建。

1.2.4 纳豆激酶的耐热性研究

粗酶液于-20，4，30，37，40，50，60 ℃分别处理1 h，以4 ℃的处理为对照，按1.2.2的方法测定溶圈直径，确定温度对酶稳定性的影响。

1.2.5 纳豆激酶的pH稳定性研究

粗酶液与Tris-HCl缓冲液按1∶1的比例混合，用0.2 mol/L NaOH将pH调至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，以pH 7.2为对照，4 ℃放置1 h后按1.2.2的方法测定溶圈直径，确定pH对酶稳定性的影响。

1.2.6 金属离子对纳豆激酶稳定性的影响

粗酶液中分别加入不同的金属离子(Mn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Hg2+、Ba2+)，终浓度为5 mmol/L，以不加金属离子的粗酶液为对照，37 ℃处理18 h后按1.2.2的方法测定溶圈直径，确定金属离子对酶稳定性的影响。

1.2.7 化学物质对纳豆激酶稳定性的影响

粗酶液中分别加入1%的牛血清蛋白、明胶、蛋白胨、丙二醇、乙醇、海藻酸钠，以不加化学物质的粗酶液为对照，37 ℃处理18 h后按1.2.2的方法测定溶圈直径，确定化学物质对酶稳定性的影响。

1.2.8 抑制剂和变性剂对纳豆激酶稳定性的影响

粗酶液中分别加入0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF(苯甲基磺酰氟)、1 mmol/L或10 mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、DTT(二硫苏糖醇)、SDS(十二烷基硫酸钠)，以不加抑制剂和变性剂的粗酶液为对照，37 ℃处理18 h后按1.2.2的方法测定溶圈直径，确定抑制剂和变性剂对酶稳定性的影响。

1.2.9 纳豆激酶的传代稳定性研究

将枯草芽孢杆菌MX-6在基础种子培养基斜面上连续传代20次，培养温度为37 ℃，培养时间为24 h。将不同代次的菌株按照1.2.1的方法培养并制备粗酶液，按1.2.2的方法测定溶圈直径，观察不同代次的菌种产酶活性变化情况，确定纳豆激酶的传代稳定性。

2 结果与分析

2.1 纤溶酶编码基因aprN的扩增及鉴定

以枯草芽孢杆菌MX-6的基因组DNA为模板，应用aprN基因的特异性引物，PCR扩增获得一条大小为1473 bp的特异性条带(图1)，测序结果与GenBank中已公布的枯草芽胞杆菌(CP017763.1、CP018184.1、CP014471.1)的aprN基因序列的同源性均达到99%以上，结果说明扩增基因序列的正确性。系统进化树显示枯草芽孢杆菌MX-6的纤溶酶与纳豆激酶E(WP 009966941.1)、纳豆激酶NAT(WP 014479360.1)、纳豆激酶前体(AA065246.1)聚合在同一分支上，表明枯草芽孢杆菌MX-6所产的纤溶酶为纳豆激酶(见图2)。

图1 枯草芽孢杆菌MX-6的aprN基因的扩增Fig.1 Amplification of aprN gene in Bacillus subtilis MX-6

图2 枯草芽孢杆菌MX-6的纤溶酶与同源纤溶酶构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of plasminogen in Bacillus subtilis MX-6 and homologous plasminogens

2.2 纳豆激酶的热稳定性

图3 纳豆激酶的热稳定性Fig.3 Thermal stability of nattokinase

由图3可知，粗酶液在-20，30～50 ℃处理1 h，酶活性基本不变(P>0.05)，但60 ℃处理1 h，发生严重失活(P<0.01)，说明纳豆激酶在30～50 ℃热稳定性较好。掌握纳豆激酶的热稳定性关系到酶的保藏、进入人体后的活性，该酶在人体温度37 ℃左右、冷藏温度4 ℃、冷冻温度-20 ℃具有较好的稳定性，具有开发为溶栓药物的基本条件之一。

2.3 纳豆激酶的pH稳定性

图4 纳豆激酶的pH稳定性Fig.4 pH stability of nattokinase

酶的本质是蛋白质，酶的催化速度随pH的变化而变化，不同的pH会影响带电荷基团的解离状态，进而影响酶的稳定性。由图4可知，pH在3～11之间，酶活性相对稳定，由于人体的胃肠道是酸性环境，枯草芽孢杆菌MX-6所产的纳豆激酶在酸性和碱性环境下均较为稳定，具有开发为肠溶剂的广阔前景。

2.4 金属离子对纳豆激酶稳定性的影响

图5 金属离子对纳豆激酶稳定性的影响Fig.5 Effect of metal ions on the stability of nattokinase

由图5可知，Mg2+、Ca2+对纳豆激酶的活性具有显著的激活作用(P<0.01)，增强酶稳定性的主要原因可能有两种：第一，可能与球蛋白的敏感部位结合，使酶的活性构象或结构更牢固；第二，可能屏蔽球蛋白表面的多余负电荷，消除其不利影响。K+、Fe2+对纳豆激酶的稳定性基本无影响(P>0.05)，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+对纳豆激酶的稳定性具有极显著的抑制作用(P<0.01)，Hg2+导致纳豆激酶完全失活，Zn2+和Hg2+的加入分别导致絮状物和大量沉淀的形成。结果与相关报道存在差异，可能是由于菌株或酶的不同所导致的。

2.5 化学物质对纳豆激酶稳定性的影响

图6 化学物质对纳豆激酶稳定性的影响Fig.6 Effect of chemical substances on the stability of nattokinase

根据相关文献报道，牛血清蛋白、明胶、蛋白胨、丙二醇、海藻酸钠等有利于纳豆激酶的稳定性[12]，而纳豆激酶工业化生产的后道工序是开放式的，易发生杂菌污染而导致酶的降解，有必要检测某些防腐剂如乙醇对酶稳定性的影响。由图6可知，牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性(P<0.01)，明胶>牛血清蛋白>蛋白胨，丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响(P>0.05)，而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性(P<0.01)。

2.6 抑制剂和变性剂对纳豆激酶稳定性的影响

由图7可知，PMSF为典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF均可导致纳豆激酶活性的完全丧失，说明枯草芽孢杆菌MX-6所产的纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的EDAT对纳豆激酶的活性基本无影响(P>0.05)，表明枯草芽孢杆菌MX-6所产的纳豆激酶不是一种金属蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的DTT对纳豆激酶的活性基本无影响(P>0.05)，进一步说明纳豆激酶结构中无二硫键的存在。1 mmol/L的SDS不会抑制纳豆激酶活性(P>0.05)，而10 mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性(P<0.01)。

图7 抑制剂和变性剂对纳豆激酶稳定性的影响Fig.7 Effect of inhibitors and denaturants on the stability of nattokinase

2.7 纳豆激酶的传代稳定性

图8 纳豆激酶的传代稳定性Fig.8 The generation stability of nattokinase

由图8可知，各代菌株所产纳豆激酶活性之间的差异不显著(P>0.05)，纳豆激酶发酵表现出稳定的遗传性能，其纳豆激酶生产性能基本保持稳定。说明纳豆激酶生产菌株枯草芽孢杆菌MX-6具备作为工业生产纳豆激酶出发菌株的前提条件。

3 结论

纳豆激酶具有成本低、活性高、可口服、安全无毒等优点，已成为当今研究的热点[13,14]。将纳豆激酶开发成为口服溶栓药物或肠溶剂，要求其具有良好的稳定性，亦是实现其工业应用的关键之一。枯草芽孢杆菌MX-6所产的纳豆激酶在-20，4，30～50 ℃的热稳定性较好；pH在3～11之间酶活性相对稳定；Mg2+、Ca2+对纳豆激酶具有显著的激活作用，K+、Fe2+对纳豆激酶的稳定性基本无影响，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+有显著的抑制作用，Hg2+导致纳豆激酶完全失活；牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性，丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响，而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性；PMSF可导致纳豆激酶活性完全丧失，EDAT和DTT对纳豆激酶的活性基本无影响，10 mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性，纳豆激酶活性具有良好的传代稳定性。相关研究显示不同纳豆激酶的稳定性存在差异，这可能是由于所用菌株或发酵培养基及粗酶制备的方法不同造成的。准确掌握纳豆激酶的稳定性有利于其生产、应用及保藏。