响应曲面法优化黑豆丹贝固体发酵条件的研究

2019-07-22武悦王坤牛广财赵婧朱丹

中国调味品 2019年7期

武悦，王坤，牛广财，赵婧，朱丹

(黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319)

丹贝(tempeh)又称天培、天贝，是源于印度尼西亚的一种大豆发酵类食品，被当地人作为主食。它是将大豆经过浸泡、脱皮、蒸煮、调酸和接种少孢根霉发酵而成的具有白色菌丝的饼状物[1,2]，因其风味独特、营养丰富、价格低廉和制作简易而备受民众喜爱。丹贝现已跻身于世界高档食品市场，且有成为全球化食品的趋势[3]。

丹贝的生产一般采用自然发酵和纯种发酵方法。虽然纯种发酵的丹贝质量不及天然发酵产品，但是它容易控制，产品质量稳定。因此，纯种发酵方法应用较多[4]。由于丹贝发酵是微生物生长及其产物形成的一系列酶促反应过程，发酵原料(底物)、发酵时间、接种量和pH等因素都会影响少孢根霉的生长和最终发酵产品的品质[5]。刘全德等以氨基氮含量为主要评价指标，结合感官评分，确定多菌种发酵制作丹贝的前发酵工艺条件为：在蒸煮大豆基质中加入3%的米粉，接种3%的乳酸菌，于42 ℃发酵2.5 h至pH值5.0，再加入5%的少孢根霉∶甜酒曲为3∶2的混合菌，于37 ℃下发酵18 h[6]。周思静等以大豆为原料，少孢根霉为发酵菌株，制备高活性β-葡萄糖苷酶丹贝的发酵工艺为：蒸煮时间20 min、接种量1.50%、发酵时间36 h的条件下β-葡萄糖苷酶活性最高，为345.63 U[7]。

目前，丹贝生产主要以大豆为原料，但也有研究采用其他豆类或豆类副产物为原料制作丹贝，如蚕豆、鹰嘴豆、油菜籽饼、玉米-大豆混合物、豆渣等[8-12]。黑豆又称乌豆、黑大豆，我国东北地区出产最多，黑豆中含有叶绿素和黑色素等花色苷类物质，黑豆的营养价值和药用价值均高于普通大豆[13]，是急需开发的黑色食品资源之一。因此，本研究以黑豆为主要原料，通过响应曲面法对黑豆丹贝的发酵工艺进行优化，从而得到最佳发酵条件，不仅能丰富丹贝的种类，还能为黑豆功能性食品的开发提供理论依据，解决了黑龙江省地产黑豆精深加工不足的问题，也为其他原料的开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑豆：购于黑龙江省建三江农场；食品级乳酸：购于郑州高研生物科技有限公司；少孢根霉(Rhizopusoligosporus)：购于南京天贝人发酵技术有限公司，孢子数量在106个/g以上。

1.2 主要仪器

电磁炉、电蒸锅广东美的生活电器制造有限公司；电子天平上海奥豪斯仪器有限公司；LRH-150型生化培养箱上海益恒实验仪器有限公司；DL-CJ-1N型超净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；L420台式低速自动平衡离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 丹贝生产工艺流程及操作要点

1.3.1.1 丹贝生产工艺流程

1.3.1.2 操作要点

选用颗粒饱满的黑豆，去除劣豆，用清水洗净，黑豆∶水为1∶3 (m/V)，室温浸泡使其易于脱皮。浸泡时间24 h，然后将豆粒置于电蒸锅中蒸熟蒸透，至松软无硬芯即可。在超净工作台中冷却至室温后，添加适量的乳酸混匀，接种少孢根霉菌粉并混合均匀，装入扎孔的发酵袋(8 cm×12 cm)中，置于恒温培养箱中发酵。

1.3.2 单因素试验设计

1.3.2.1 发酵时间对丹贝品质的影响

在接种量0.25%、乳酸添加量1.0%、发酵温度34 ℃的条件下，研究发酵时间(24，30，36，42，48 h)对丹贝品质的影响。

1.3.2.2 发酵温度对丹贝品质的影响

在接种量0.25%、乳酸添加量1.0%、发酵时间30 h的条件下，研究发酵温度(28，31，34，37，40 ℃)对丹贝品质的影响。

1.3.2.3 少孢根霉接种量对丹贝品质的影响

在乳酸添加量1.0%、发酵温度31 ℃、发酵时间30 h的条件下，研究少孢根霉菌粉接种量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)对丹贝品质的影响。

1.3.2.4 乳酸添加量对丹贝品质的影响

在接种量0.25%、发酵温度31 ℃、发酵时间30 h的条件下，研究乳酸添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)对丹贝品质的影响。

1.3.3 响应曲面试验设计

根据单因素试验结果以及Box-Benhnken的中心组合设计原理，选择发酵时间、发酵温度、接种量、乳酸添加量4个因素，以感官评分为指标，对黑豆丹贝的发酵工艺进行优化，其因素水平表见表1。

表1 响应曲面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 测定方法

1.3.4.1 产品感官评定

黑豆丹贝的感官评分方法见表2。

表2 黑豆丹贝的感官评分方法Table 2 Sensory evaluation method of black soybean tempeh

1.3.4.2 其他指标测定

氨基酸态氮：采用GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》；还原糖：采用3,5-二硝基水杨酸法；可溶性蛋白质含量：考马斯亮蓝G-250染色法[14]。大肠菌群计数：采用GB 4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》；菌落总数：采用GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对黑豆丹贝品质的影响

发酵时间过短，菌种生长不佳，制备的丹贝质量较差；时间过长，容易产生不良气味，所以选择合适的发酵时间至关重要。

图1 发酵时间对黑豆丹贝感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation time on sensory score of black soybean tempeh

由图1可知，随着发酵时间的延长，感官评分呈先升高后降低的趋势。当发酵时间为24 h时，丹贝表面菌丝过少，豆瓣松散，无香味；当发酵至36 h时，豆瓣表面菌丝致密，香味醇正，无异味，此时感官评分最高，为83.6；当发酵时间超过42 h时，丹贝的品质开始下降，表面有黑色孢子和不良气味产生。因此，发酵时间在30～42 h时，丹贝的品质较好。

2.2 发酵温度对黑豆丹贝品质的影响

发酵温度对丹贝品质的影响较大，见图2。

图2 发酵温度对黑豆丹贝感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score of black soybean tempeh

由图2可知，当温度为28 ℃时，豆瓣表面菌丝过少，豆瓣松散，丹贝的品质较差，感官评分很低；当温度为31～34 ℃时，黑豆丹贝的菌丝较致密，部分豆瓣松散，香味较浓；当温度大于37 ℃时，丹贝发酵温度偏高，开始有少量孢子产生，颜色偏黄并伴有腐败气味。以感官为评定指标，可得出发酵温度为34 ℃时，丹贝的品质最佳。因此，发酵温度在31～37 ℃时，丹贝的品质较好。

2.3 接种量对黑豆丹贝品质的影响

接种量是影响丹贝品质的重要因素之一，接种量过少，菌丝生长缓慢，分解蛋白质不完全，无法形成完整、致密的糕团状；接种量过高，会因过度分解蛋白质而有轻微腐败气味，且会产生孢子，从而影响产品的外观和气味。

图3 接种量对黑豆丹贝感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on sensory score of black soybean tempeh

由图3可知，在接种量在0.20%～0.30%时，黑豆丹贝的感官评分较高。

2.4 乳酸添加量对黑豆丹贝品质的影响

添加乳酸不仅可以为少孢根霉的生长提供适宜的环境，还可以抑制其他杂菌的生长。

图4 乳酸添加量对黑豆丹贝感官评分的影响Fig.4 Effect of the additive amount of lactic acid on sensory score of black soybean tempeh

由图4可知，感官评分随着乳酸添加量的增加呈先增高后降低的变化。当乳酸添加量为0.5%时，酸度较低不利于菌丝的生长，且伴有腐败气味，可能是由于杂菌生长所致；当乳酸添加量在1.5%时，基质的酸度适合少孢根霉的生长，发酵后黑豆丹贝的表面菌丝致密，呈乳白色糕团状，质地结实有弹性，香味浓郁，产品质量好；当乳酸添加量大于2.0%时，可能是基质过酸抑制了少孢根霉的生长，丹贝品质较差。因此，乳酸添加量在1.5%左右时，黑豆丹贝的品质较好。

2.5 响应面法优化试验

2.5.1 模型建立及显著性分析

采用Design-Expert 8.0.6软件，对表3试验结果进行二次多项回归拟合，得到以产品感官评分为响应值，发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)和乳酸添加量(D)之间的回归方程为：Y=87.72+2.57A+1.28B+3.84C+11.03D-2.05AB+3.83AC+4.07AD-2.57BC+3.75BD-2.42CD-6.73A2-5.96B2-5.94C2-7.43D2。

表3 响应曲面试验方案及结果Table 3 Design and result of response surface experiment

续表

表4 响应面回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4可知，回归模型高度显著(P<0.0001)，而失拟项不显著(P=0.0971>0.05)，决定系数R2=0.9325，表明该模型对试验拟合度较好，试验误差较小，可以用此模型进行分析和预测。由F值可知各因素对产品感官评分影响的主次顺序为：D>C>A>B，即乳酸添加量>接种量>发酵时间>发酵温度。交互项AD的P<0.05，AB、AC、BC、BD和CD的P>0.05，因此，A(发酵时间)和D(乳酸添加量)的交互作用显著，其他因素的交互作用不显著。

2.5.2 响应曲面分析

响应曲面图能直观反映发酵时间和乳酸添加量对黑豆丹贝感官评分影响的整体趋势，等高线形状可以反映交互作用大小，其排列的密集程度表明发酵时间和乳酸添加量变化对产品感官评分的影响程度[15]。

图5 发酵时间和乳酸添加量的响应曲面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour map of fermentation time and additive amount of lactic acid

由图5可知，在接种量和温度不变的情况下，固定发酵时间，黑豆丹贝的感官评分为先陡峭上升到达最大值后再缓慢下降，表明乳酸添加量对丹贝的感官品质影响较大，且在较低水平下对丹贝感官质量的影响比高水平突出。同时，等高线呈椭圆形，说明发酵时间和乳酸添加量的交互作用显著。

2.5.3 验证试验

采用Design-Expert 8.0.6软件分析，得到最优的理论条件为：发酵时间39 h，发酵温度34.75 ℃，接种量0.26%，乳酸添加量1.45%，模型预测感官评分值为94.51分。考虑到实际操作的便利，将参数修整为：发酵时间39 h，发酵温度35 ℃，接种量0.26%，乳酸添加量1.5%。采用上述条件进行实际发酵，做3次试验取其平均值，得到感官评分为93.9分，与预测值差异不显著，表明模型拟合程度较好，可以用该发酵条件制作黑豆丹贝。