酵母对苹果汁发酵果醋不同阶段风味影响的分析

高鹏岩，刘瑞山，张晓娟，陆震鸣，史劲松，许正宏，李崎

(1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.福建绿泉食品有限公司，福建 漳州 363200)

苹果是我国主要的水果产品之一，除鲜食外，主要用于加工生产浓缩苹果汁[1]。苹果醋是近年兴起的一种健康饮品，是以新鲜苹果或苹果汁为原料通过酒精发酵、醋酸发酵而成。这一发酵产品既改善了苹果原料的风味品质，还具有促进食欲、消食化滞等功能。苹果醋在风味和健康功能两方面受到市场和消费者的普遍认同，因此也是提高苹果附加值的可行深加工方式[2]。

苹果醋中有机酸除乙酸外，还含有苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等不挥发酸，这些不挥发酸可以降低乙酸的刺激性，使酸味更柔和、醇厚[3-5]。氨基酸是苹果醋中重要的营养与呈味物质，不仅具有特殊的味感，包含酸、甜、苦、鲜、涩[6,7]，还可以生成香味物质贡献呈香能力[8]。有机酸、游离氨基酸和挥发性物质对苹果醋独特风味的形成具有重要意义。

不同的微生物发酵得到的食品、饮品会存在不同的风味特征。陈佳楠等[9]研究了4种不同酿酒酵母对黄酒挥发性物质形成的影响，结果表明不同菌株酿造的黄酒样品挥发性物质存在明显差别。在发酵乳制品中，不同菌种也会影响酸奶、奶酪等发酵食品的口感、品质和风味特征[10]。因此，本文以浓缩苹果汁为原料，通过分析苹果醋发酵过程中有机酸、氨基酸和风味物质组成变化，解析不同酿酒酵母参与发酵的苹果酒和苹果醋的风味差异。通过分析这些感官差异背后的物质基础，追踪微生物的代谢行为差异，可以为产品开发和评价提供重要的基础信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与菌种

浓缩苹果汁(70 °Brix)：来自福建绿泉食品有限公司；酿酒酵母JNU-S2、酿酒酵母JNU-R6、巴氏醋酸菌：本实验室保藏。

1.1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；Agilent 1100氨基酸分析仪 美国安捷伦科技有限公司；Trace1310-ISQ LT气质联用仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 苹果醋发酵工艺

1.2.1 工艺流程

浓缩苹果汁→调整糖度→灭菌→酒精发酵→过滤→醋酸发酵→过滤→发酵成品→参数测定。

1.2.2 步骤

调整糖度：将浓缩苹果汁的糖度调整为15 °Brix。

酒精发酵：酿酒酵母JNU-S2和酿酒酵母JNU-R6分别以3%的接种量接入苹果汁中，于30 ℃静置发酵。每隔24 h测定酒精度和残糖的变化。

醋酸发酵：初始酒精度为6%左右，接种量为4%，发酵温度为30 ℃，摇床转速为180 r/min，每隔24 h测定其总酸变化。

1.3 测定方法

1.3.1 还原糖的测定

参考GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》中的直接滴定法。

1.3.2 乙醇的测定

参考GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法。

1.3.3 总酸的测定

参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法。

1.3.4 有机酸的测定

参考GB/T 18623—2011《地理标志产品镇江香醋》中有机酸的检测。

1.3.5 游离氨基酸分析

参考QB/T 4356—2012《黄酒中游离氨基酸的测定 高效液相色谱法》。

1.3.6 挥发性物质分析

参考魏晋梅等[11]的挥发性风味物质测定方法。

1.3.7 风味物质差异分析

基于R语言的DESeq2包对风味物质数据进行差异分析，以log2(Fold Change)为横坐标，以显著性P值的负对数-log10(p-value)为纵坐标绘制火山图。利用一定的筛选条件(Fold Change>2，显著性P值<0.05)，即可筛选出显著性差异的关键风味物质，进行差异分析。

2 结果与分析

2.1 两株酿酒酵母分别参与的苹果醋发酵过程

图1 15 °Brix的苹果汁在两株酿酒酵母参与下发酵果酒和果醋的过程曲线Fig.1 Process curve of fruit wine and fruit vinegar fermented by apple juice of 15 °Brix with the participation of two strains of Saccharomyces cerevisiae

两株酿酒酵母在15 °Brix苹果汁中都可以发酵完全，最终酒精度均为6.1%左右(见图1)。酿酒酵母JNU-R6的糖耗速率和产乙醇速率略高于JNU-S2。发酵第2天两株菌的差异最显著，酿酒酵母JNU-R6对糖的转化力更强。上述不同酵母发酵得到的苹果酒在接种醋酸菌后进行醋酸发酵，不同的果酒在醋酸发酵阶段总酸变化趋势基本相同。

通过初步的感官评价，两株酿酒酵母参与的苹果醋口味都比较纯正，具有典型的苹果醋风味特征。同时两种果醋也具有明显的感官区别，苹果醋R酸感强烈，风味浓郁突出；而苹果醋S的风味相对清淡柔和，苹果的果香风味更显著。这一结果说明虽然发酵过程曲线非常相似，且总酸基本相同，但是具体的代谢物成分和比例存在一定差异。这是由两株酿酒酵母的代谢特性决定的，因此本文重点关注决定这种感官差异的物质基础，从有机酸、游离氨基酸、挥发性风味物质方面做细化分析。

2.2 苹果醋发酵各阶段有机酸组成

本文主要对苹果醋发酵过程中的10种有机酸进行了分析，其中乙酸是醋酸发酵阶段的主要产物，苹果醋R和苹果醋S中的乙酸含量分别为52.5 g/L和49.2 g/L，苹果醋S含有更少的乙酸，是其口感相对淡爽的原因之一。此外，其他几种含量相对较少的有机酸对口感也有显著的贡献，结果见图2。苹果汁中含量最高的为苹果酸和酒石酸，分别占有机酸总量的81.2%和9.1%。苹果酒R中苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸含量较高，分别为49.6%、13.4%、12%、9.2%；苹果酒S中苹果酸、柠檬酸、琥珀酸含量分别为55.28%、8.81%、26.04%，没有检测到乳酸；苹果醋R中苹果酸和柠檬酸含量较高，其中苹果酸呈味缓慢，保留时间较长，而柠檬酸酸味圆润，但后味持续较短。因此也是苹果醋R风味浓郁、层次丰富的重要原因之一。

图2 苹果醋发酵各阶段主要的有机酸组成Fig.2 Composition of major organic acids in different fermentation stages of apple vinegar

2.3 苹果醋发酵各阶段游离氨基酸的组成

表1 苹果醋发酵各阶段游离氨基酸的变化Table 1 Changes of free amino acids in various fermentation stages of apple vinegar

许多氨基酸都有一定的呈味作用[12,13]，如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸等具有鲜味，因此氨基酸对苹果醋的整体风味有显著影响。由表1可知，苹果汁中氨基酸含量丰富，主要有天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸。经过酒精发酵后，由于可以在生物合成中被酵母菌优先利用，天冬氨酸和谷氨酸显著减少[14]。果酒R和果酒S中总氨基酸含量较原果分别减少了76.01%和83.01%，同时果酒中亮氨酸、赖氨酸有所增加，可能来自酵母发酵过程中的代谢产物或发酵完毕后的酵母细胞自溶。果醋中总氨基酸含量约为苹果酒的2倍，其中苯丙氨酸的含量分别提高了10倍(R)和果醋8倍(S)，缬氨酸分别提高了3倍(R)和4倍(S)。此外果醋R比S中积累更多的苏氨酸和亮氨酸，构成两者不同的风味差异。

果酒中的必需氨基酸含量较原果汁有所降低，但经过醋酸发酵之后，又得到显著积累(见图3)。果醋R中的必需氨基酸为原果汁中的3.8倍，果醋S中的必需氨基酸为原果汁中的1.6倍。酿酒酵母JNU-R6参与发酵得到的苹果醋氨基酸积累更多，这也是果醋R风味更加浓郁的原因之一。

图3 不同发酵阶段果醋中必需氨基酸的组成Fig.3 Composition of essential amino acids in apple vinegar at different fermentation stages

2.4 苹果醋发酵过程中挥发性风味物质的变化以及关键差异物质分析

图4 苹果醋发酵过程中风味物质的变化Fig.4 Changes of flavor substances in apple vinegar fermentation process

挥发性风味物质对苹果醋的品质和感官特征都有重要作用。苹果醋在整个发酵过程中共检测到111种挥发性风味物质，检测到的部分挥发性化合物在苹果醋发酵过程中的变化规律见图4。苹果汁中含量较高的风味物质为糠醛、棕榈酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚，分别占总含量的15.2%、9.7%、7.8%。棕榈酸乙酯是重要的天然产物，呈微弱蜡香和奶油香气[15]，而糠醛和2，4-二叔丁基苯酚可能产生于浓缩苹果汁的加工过程[16]。

苹果汁经酒精发酵后高级醇和酯类化合物含量和种类更加丰富，果酒R中酯类物质增加到36种，果酒S增加到17种，发酵过程生成的多种酸类和醇类为酯类的形成提供了丰富的前体。醋酸发酵后，风味物质的种类和含量有所减少，果醋R和果醋S中酯类物质分别减少到17种和14种。在醋酸发酵阶段，酯类物质被进一步水解或转化是一部分原因，同时发酵过程中搅拌和通风也造成了挥发性风味物质的损失。苹果醋中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸异丁酯是含量最高的酯类物质。

图5 苹果醋R和苹果醋S风味物质差异分析Fig.5 Analysis on the differences of flavor substances between apple vinegar R and apple vinegar S

对两种果醋进行了挥发性风味物质的差异分析(见图5)，两种苹果醋的主体风味成分有乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、异戊醇、苯乙醇，其中乙酸异戊酯和乙酸异丁酯具有香蕉和梨水果香味，乙酸苯乙酯为甜的玫瑰花香味，异戊醇有苹果白兰地香气和辛辣味。苯乙醇具有柔和持久的玫瑰香和蜜香，是果醋中重要的芳香化合物[17]。根据差异分析结果发现苹果醋S比苹果醋R显著增加的主要风味物质有乙酸乙酯、异丁醇等，其中乙酸乙酯含量提高了2倍；显著减少的主要风味物质有乙酸异戊酯、辛酸、葵酸、己酸。其他主要的风味物质如乙酸、异戊醇、苯乙醇均无显著差异。苹果醋S较苹果醋R含有更多的乙酸乙酯和较少的辛酸、葵酸，这也是果醋S口感较柔和的原因。

3 结论

本文研究了以浓缩苹果汁为原料，由两种酵母菌种发酵成苹果酒，再经巴氏醋酸菌发酵成苹果醋的过程。通过对果醋的风味特征进行初步评价，确证了由两株酿酒酵母导致的产品感官特征的差异。

果醋中除了乙酸为主体代谢产物以外，大部分果汁中的苹果酸得到保留，同时也积累了少量柠檬酸，增加了果醋感官上的层次感。醋酸发酵后，果醋中的必需氨基酸含量较原果汁提高了2～4倍，但损失了大量挥发性风味物质。果醋R含有较多的乙酸、苹果酸、柠檬酸，因此酸味更加强烈突出，余味持久，并且含有更多的必需氨基酸，增加了入口的丰富度以及营养价值。而果醋S中的风味物质含量相对较少，各物质组成也较平衡协调，决定了果醋S风味纯净、柔和淡雅的风味特征。本文研究了乙醇和乙酸这两种主要的代谢产物以外，其他含量相对较少的物质对产品风味的影响，细化了不同的微生物通过其独特的代谢行为对发酵产物中各风味物质积累的偏好性。结果表明在果酒发酵阶段由于不同菌种造成的代谢物差异，不仅会带入到果醋终产品中，也会对果醋发酵阶段醋酸菌的代谢产生扰动。本文的研究结果，可以拓展到其他种类原料的液态发酵醋饮品的开发和品质分析中。