毛尖茶叶中的黄酮类化合物对脂氧合酶的抑制性

2019-07-19吴桂玲代虹镜邓維先

云南化工 2019年4期

吴桂玲，代虹镜，邓維先，罗骏

（黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀 558000）

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗称脂肪氧化酶，是广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的一类非血红素铁蛋白。它专门催化具有顺，顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应，在植物体中脂氧合酶将亚油酸和亚麻酸转化成氢过氧化脂肪酸[1-2]，最后由于其他酶的作用，产生了具有特殊风味的酯类物质[2]，比如说大豆的豆腥味，谷子的陈化[3]。因此，寻找高效、低毒的选择性LOX 抑制剂已经成为一个重要的研究方向。黄酮类化合物是一类低分子量的广泛存在于云祥科、唇形科、豆科等天然植物中，是植物重要的次生代谢产物。黄酮类化合物除具有抗炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外[4]，还在抗氧化方面、抗癌方面、抑制脂氧合酶方面等有显著地效果[5-6]。因此黄酮类化合物的提取及其对脂氧合酶的抑制的研究等方面有重要意义。也可作为体外筛选天然抗肿瘤活性物质的一种有效方法。本文对都匀毛尖茶叶中的黄酮类化合物对大豆脂氧合酶的抑制作用进行研究。为天然抗氧化剂(黄酮类化合物)的提取及其对脂氧合酶(LOX)抑制机理的研究奠定了基础，为合理应用黄酮类化合物对脂氧合酶的特殊作用来保鲜水果、蔬菜提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

材料：毛尖茶叶，采自都匀牛场；大豆，市售。

试剂：亚油酸(Sigma 生产，纯度99.9%)；芦丁，含量≥95.0%；Tween20；柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；硼酸缓冲液，其他化学试剂均为分析纯。

仪器：旋转蒸发器RZ-2000Z，郑州英峪予华仪器有限公司；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；pH-ZC 数字式酸度计，上海理达仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作

将芦丁标准样品在温度100℃下干燥直到芦丁重量不再产生变化，用电子分析天平准确称取样品0.0200 g，先加适量无水甲醇，使芦丁完全溶解，再加无水乙醇，定容到100 mL，得到的芦丁标准溶液，质量浓度为0.20 mg/mL。

分别精密吸取五组不同体积的芦丁标准溶液置于5 个25 mL 的容量瓶中，用30%乙醇溶液补充至12.5 mL，加入1 mL 5%的NaNO2摇匀放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5min 后，再加入10 mL 4%的NaOH 摇匀，用30%乙醇稀释至刻度，10 min 后用紫外分光光度计在波长510 nm 处进行测定，以溶剂做空白参比。根据实验数据得到芦丁标准溶液的标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 Standard curves of rutin

用最小二程法进行线性回归得芦丁溶液质量浓度C(mg/mL)与吸光度值A 关系曲线的回归方程式为Y=10.87412C+0.0086，相关系数R2=0.9995。

1.2.2 黄酮类化合物的提取

将毛尖茶叶洗净放入烘箱中在70℃的条件下烘干，用中草药粉碎机粉碎，过20 目的分子筛（粉碎得越细越好）。称取20 g 的茶叶粉末于500 mL 的圆底烧瓶中，按固液比为1∶20（g/mL）准确量取400 mL 石油醚与茶叶粉末混匀浸泡一段时间，将浸泡好的茶叶回流，趁热将回流好的茶叶抽滤，将滤渣用400 mL 石油醚再浸泡回流，取滤渣用400 mL 的无水乙醇回流，将滤液在50℃的条件下旋转蒸发，加入无水乙醇使黄酮类化合物完全溶解。将其分别用500 mL、250 mL的容量瓶定容为750 mL。

1.2.3 黄酮类化合物含量的测定

取1 mL 黄酮类化合物溶液置于25 mL 的容量瓶中，向容量瓶中加入10 mL 无水乙醇摇匀后，用30%乙醇溶液补充至12.5 mL，加入1 mL5%的NaNO2摇匀放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5 min 后，再加入10 mL4%的NaOH 混匀，用30%的乙醇稀释至刻度，10 min后用紫外可见光分光光度计在波长510 nm 处进行测定，以溶剂做空白参比。

1.2.4 大豆中脂氧合酶（LOX）的提取[7]

将大豆用蒸馏水洗净，在低温下（0~10)℃的条件下将大豆磨碎后再经石油醚多次浸提后得到脱脂大豆粉。称取24.3 g 脱脂大豆粉为原料，料液比为1∶10（g/mL），加入去离子水并用1 mol/L 的盐酸调pH 值至4.5，搅拌50 min，抽滤；向滤液中加入固体硫酸铵至40%饱和，将滤液用2000 r/min 的离心机低温（4℃左右）离心20 min；取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的饱和度达到60%。再次离心20 min，将沉淀用pH9.0 的0.2 mol/L 的硼酸盐缓冲液溶解，溶液即为大豆的粗酶液，放入冰箱冷藏备用。

1.2.5 大豆中脂氧合酶（LOX）的活性测定

底物的制备：先配制10 mL 硼酸盐缓冲溶液，使其pH 值为9.0，浓度为0.2 mol/L，然后取Tween20 0.25 mL 分散在该缓冲溶液中，边摇动溶液边滴加亚油酸0.27 mL，充分摇匀，使它们混合均匀，再加入一定体积的浓度为1 mol/L 的NaOH 溶液，边加边摇动，直到使整个溶液澄清，将溶液pH 值调到9.0，然后用上述硼酸盐缓冲液稀释定容到500 mL 作为底物备用。

取一只洁净干燥的试管分别向试管中5.5 mL的pH 值9.0 的硼酸盐缓冲液，100 μL 的底物，0.4 mL 酶液（已稀释一定倍数），摇匀后立即将试管至于60℃(在该温度下酶的活力和黄酮类化合物的抑制效果均比较明显) 的水浴中恒温2 min 时测反应液在234 nm 处吸光度。以溶剂做空白参比。重复做两次平行实验。根据公式X=1000×(A1-A0)/3（X:酶的活性；A1：5min 时测定的吸光度；A0：2min 时测定的吸光度；3：第二次测定时间-第一次测定的时间）计算酶的活性。

1.2.6 黄酮类化合物对大豆脂氧合酶的抑制率的测定

分别取体积为4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL 的黄酮类化合物于5 只洁净干燥的试管中，将5 只试管分别重复1.2.5 的步骤测出反应液在234 nm 出的活性（将其中的缓冲液换为pH 值为9.0 的硼酸缓冲液）。按照抑制率计算公式：Y=(B0-B1)/B0×100%计算其抑制率。