miR-424-5p过表达对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响

李自涛，马志军，刘震，沈国双

(青海大学附属医院，西宁810001)

2018年全球癌症统计数据显示，乳腺癌已成为仅次于肺癌的第二高发恶性肿瘤[1]。在我国乳腺癌是城市女性的第一杀手，近年来其发病率逐年升高并呈年轻化趋势[2]。但目前对乳腺癌发病的分子机制尚不完全清楚。微小RNA(miRNA)在真核生物体内广泛存在，是一类内源性非编码小分子RNA，长度为19～25个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3′UTR非特异性结合，在转录后水平抑制基因翻译，从而调控下游靶基因表达。miRNA几乎参与细胞所有的生理过程[3，4]。近年研究发现，miRNA还可参与肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程[5,6]。miR-424属于miR-16家族，是一个由22个碱基组成的小核酸分子，定位于X染色体上，可参与宫颈癌、卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程[7～10]。miR-424-5p是由miR-424前体5′端臂加工而来，其在肿瘤细胞中的表达具有差异性，如在胰腺癌、舌鳞癌等肿瘤细胞中高表达，而在肺癌、肝癌、宫颈癌等肿瘤细胞中低表达，可能具有促癌或抑癌双重作用[8～11]。但目前miR-424-5p表达变化与乳腺癌细胞恶性生物学行为关系的报道较少。2016年10月～2018年12月，我们观察了miR-424-5p过表达对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞MCF-7(以下称MCF-7细胞)，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。miR-424-5p与内参U6引物序列，由北京天根生化科技有限公司设计合成。miR-424-5p mimics与阴性对照序列(miRNA negative control)，由广州市锐博生物科技有限公司提供。荧光显微镜，日本Olympus公司；多功能酶标仪，德国Eppendorf公司；7500 Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司。riboFECTTMCP转染试剂、riboMONITORTMCP转染指示剂，广州市锐博生物科技有限公司；miRcute miRNA Isolation Kit、miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit，北京天根生化科技有限公司；噻唑蓝(MTT)，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 细胞分组与转染 将MCF-7细胞接种于含10% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞融合80%～90%时，用0.25%胰酶消化，按1∶2传代。取传3代、对数生长期、生长状态良好的MCF-7细胞，接种于24孔板，随机分为miR-424-5p组、阴性对照组、空白对照组，每组设3个复孔。然后将24孔板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，当细胞完全贴壁时，miR-424-5p组加入miR-424-5p mimics 1.25 μL和转染试剂34.25 μL，阴性对照组加入miRNA negative control 1.25 μL和转染试剂34.25 μL，空白对照组仅加入等量转染试剂，然后将24孔板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中转染48 h。

1.3 各组miR-424-5p表达检测 收集各组转染48 h细胞，采用离心柱法提取细胞总RNA，经超微量核酸分析仪鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，说明提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)说明进行PCR扩增。引物序列：miR-424-5p上游引物5′-CTCGAGAACTCGAGTCACCCACTACGTTGTTCCAAG-3′，下游引物5′-GAATTCAAGAATTCGGTGGTATTCTGATTGGGAAGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系共20 μL：2×miRcute Plus miRNA Premix (with SYBR&ROX) 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 0.4 μL，miRNA第一链 cDNA 2 μL，ddH2O 6.6 μL；反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞增殖能力检测 采用MTT法。收集各组转染48 h细胞，用移液枪轻轻吹打，制成单细胞悬液，细胞密度为1×104个/mL。将细胞悬液接种于24孔板，每孔500 μL，然后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。分别于培养0、24、48、72 h，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，然后加入DMSO 100 μL，轻微震荡10 min，使结晶充分溶解。酶标仪于490 nm波长处检测各孔的OD值。以OD490值表示细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.5 各组细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。收集各组转染48 h细胞，用移液枪轻轻吹打，制成单细胞悬液，细胞密度为1×104个/mL。预先用marker笔在6孔板背面均匀划横线，每孔至少5条。将细胞悬液接种于6孔板，每孔500 μL，然后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，用1 mL移液器枪头垂直划一条过孔心的直线，并尽量与预先在背面划的横线垂直。PBS冲洗，去除脱落细胞，加入无血清培养基，继续培养24 h。显微镜下拍照，PhotoZoom Pro7.0软件测量细胞划痕距离。以初始划痕距离-终末划痕距离表示细胞迁移能力。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组miR-424-5p表达比较 miR-424-5p组、阴性对照组、空白对照组miR-424-5p相对表达量分别为1.68±0.08、0.43±0.05、0.43±0.02。miR-424-5p组miR-424-5p相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较P>0.05。

2.2 各组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 各组培养不同时间细胞增殖能力比较

注：与空白对照组同期比较，*P<0.01；与阴性对照组同期比较，#P<0.01。

2.3 各组细胞迁移能力比较 miR-424-5p组、阴性对照组、空白对照组细胞迁移距离分别为(30.33±4.73)、(62.67±5.51)、(61.67±4.04)μm。miR-424-5p组细胞迁移能力明显低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较P>0.05。

3 讨论

目前，乳腺癌发病率已跃居我国女性恶性肿瘤的首位，并呈年轻化趋势。乳腺癌早期通过外科手术为主的综合治疗，患者5年生存率80%以上[12，13]。但乳腺癌早期症状不明显且多伴有淋巴结转移，大部分患者确诊时已属中晚期，而中晚期乳腺癌预后不理想，特别是晚期乳腺癌，中位生存期仅2～3年[14，15]。钼靶检查是早期筛查乳腺癌的重要手段，但鉴于我国国情，并未广泛普及。因此，临床迫切需要一种新的筛查手段和治疗途径，来提高乳腺癌早期诊断和中晚期治疗效果。

miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，在真核生物体内广泛存在，可参与基因转录后调控。据估计，miRNA能够调控超过60%蛋白质编码基因的表达，几乎参与调控细胞所有的生物学过程[3]。近年研究发现，miRNA还可作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程[4]。miR-424是miR-16家族成员之一，定位于人染色体Xq26.3[5]。有研究发现，miR-424在肺癌、宫颈癌、胰腺癌等恶性肿瘤中异常表达，其异常表达与恶性肿瘤的发生、发展有关[16～19]。miR-424-5p是由miR-424前体5′端臂加工而来。Zhou等[20]研究发现，miR-424-5p可通过Notch信号传导途径靶向KDM5B，从而抑制宫颈癌细胞增殖。Wang等[21]研究发现，miR-424-5p通过SMAD7通路介导上皮间质转化，从而参与食管鳞癌的侵袭和转移；采用miR-424-5p mimics上调食管癌EC-1细胞miR-424-5p表达，可降低其细胞增殖、侵袭和迁移能力。Wu等[22]研究发现，miR-424-5p表达上调可促进胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，并能抑制其凋亡。以上研究表明，miR-424-5p在宫颈癌、食管鳞癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。但目前关于miR-424-5p表达与乳腺癌细胞恶性生物学行为关系的报道较少。

本研究结果发现，miR-424-5p组miR-424-5p相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。说明本研究采用的瞬时转染技术能够使MCF-7细胞miR-424-5p过表达。进一步观察miR-424-5p过表达对MCF-7细胞增殖和迁移的影响发现，miR-424-5p组转染48 h再培养72 h细胞增殖能力明显低于阴性对照组和空白对照组，说明miR-424-5p过表达能够抑制MCF-7细胞增殖能力；miR-424-5p组细胞迁移能力明显低于阴性对照组和空白对照组，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义，表明miR-424-5p过表达可抑制MCF-7细胞迁移能力。但目前miR-424-5p过表达抑制乳腺癌细胞增殖和迁移能力的机制尚不完全清楚，有待于进一步研究。

综上所述，miR-424-5p过表达可抑制乳腺癌细胞增殖和迁移能力。miR-424-5p有可能成为治疗乳腺癌的一个潜在靶点。